HPLC脱离条件优化步骤以及定量计算公式选择.ppt

HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择 1. HPLC分离优化基本概念 4.定量计算公式的选择 4.定量计算公式的选择 4.定量计算公式的选择 4.定量计算公式的选择 4.定量计算公式的选择 分离条件的优化 定量计算公式的选择 HPLC分离优化基本概念 主要内容 确定分离模式与色谱柱 一、分离度与基本色谱分离方程式 1、分离度——柱的总分离效能指标 柱效参数： 标准偏差(?): 即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半 半峰宽(W1/2): 色谱峰高一半处的宽度W1/2 =2.354? 峰底宽(W)：W=4? 1. HPLC分离优化基本概念 R=1.5，色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离开； R=1.0，表明两个相邻组分只有94%分离开。(最低指标） 分离度表达式： R=n1/2/4?(α-1)/α?k2 ′ /(1+k2 ′ ) R受热力学因素[容量因子k ′和选择性系数α（ α = k2 ′ / k1 ′ ）]和动力学因素（理论塔板数n）两个方面控制。 若相邻两峰的峰底宽近似相等，令W2=W1=W ，引入相对保留值和塔板数，分离度公式演变为下式： 柱效项 柱选择项 柱容量项 1. HPLC分离优化基本概念 2、色谱分离基本方程式 2.1、分离模式的选择 2.确定分离模式与色谱柱 2.2色谱柱的选择 2.确定分离模式与色谱柱 首选C18/C8：以15cm为佳，可解决80％的样品分析，柱效应大于50000。 特殊样品用特定的柱子 不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不同柱子比例会不一样。 不同色谱柱需合适的pH范围，一般在2.5-7.5之间，有的色谱柱比较耐碱，kromasil可以到10，而杂化xterra在1－12,XDB在pH3-11. 3.1 容量因子和死时间的测量 在HPLC分析中，容量因子k′是一个非常重要的参数，对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作用。 k′=t ′R／t M t ′R = t R - t M 在HPLC分析中，死时间表示了一个在高效液相色谱固定相上未被滞留组分的保留时间。 3.分离条件的优化 1.由色谱柱的结构参数进行计算 t M = Lπr2 εT / F 式中，L为柱长，cm；r为柱内径半径，cm；F为流动相体积流速，cm3/s； εT 为总孔率，对全多孔固定相为0.84，对化学键和固定相、离子交换剂为0.75，对薄壳型固定相为0.42。 死时间t M的测量比较困难，有以下几种方法： 3.分离条件的优化 2.由色谱柱的操作参数进行计算 t M =ΦηL2/△pd p2 式中，Φ为阻抗因子；η为流动相的动力黏度；L为柱长； △p为柱压力降；d p为固定相粒径 3.依据经验公式计算 当dc/dp≥10 时，可按下述公式计算 t M： t M =L / u 对全多孔固定相 u=1.5F/dc2 对非多孔固定相 u=3F/dc2 3.分离条件的优化 4.液固色谱死时间 用RID（折光指数检测器）检测：若以正己烷与极性改性剂作流动相，可以正戊烷作探针测死时间。 用UVD（紫外吸收检测器）检测：可以苯、四氯乙烯或KNO3水溶液作探针测死时间 3.分离条件的优化 5.液液色谱死时间 用RID检测：可以重水（D2O）、重氢甲醇（CD3OH）作探针测死时间。 用UVD检测：反相可用NaCl、NaNO3、HNO3、HClO3、苯甲酸、苦味酸、尿嘧啶水溶液作探针测死时间，测量误差较大。正相可用四氯乙烯、四氟乙烯作探针测死时间。 3.分离条件的优化 3.2 色谱柱操作参数的选择 色谱柱操作参数：柱长L、柱内径Φ、柱内填充固定相的粒度d p、柱压力降△p和对应于每米柱长的理论塔板数n表示的柱效。 分析型色谱柱，选择操作参数的一般原则如下： 色谱柱长L 10~25cm；柱内径 Φ （直径） 4~6mm；固定相的粒度d p 5~10μm；柱压力降△p 5~14MPa；理论塔板数 n （2~5）×10 3~（2~10） ×10 4块/m 3.分离条件的优化 3.3 样品组分保留值和容量因子的选择 选择好操作参数后，通常希望完成一个简单样品的分析时间控制在10~30min之内，若为含多组分的复杂样品，分析时间控制在60min以内。 保留时间和容量因子由色谱过程的热力学因素控制，可通过改变流动相的组成和使用梯度洗脱来进行调节。 若使用恒定组成流动相洗脱，与组分保留时间对应的容