13C辅助超高效液相色谱踩重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度.docVIP

13C辅助的超高效液相色谱踩重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度 　　摘要毕赤酵母作为一种高效的外源蛋白表达平台，其蛋白表达水平与胞内代谢物浓度紧密相关。但胞内代谢物种类多、物化性质差异大、浓度低、周转快，对其绝对浓度的精确检测一直难于实现。本研究将超高效液相色谱三重四极杆质谱联用分析方法与1C同位素标记技术相结合，探索解决该难题的方法。首先，优化了超高效液相色谱的操作条件，利用种色谱柱实现了6种常见中间代谢物的分离；对三重四极杆质谱仪的检测离子对和碰撞电压等操作条件进行优化，找到了对各种物质具有专一性的检测离子对。然后，利用全标记1C标记底物培养细胞，收集胞内的全标记代谢物用作定量内标物，建立了种中间代谢物的标准曲线。实验结果表明，本方法不但精确性高，标准曲线相关系数达到99以上，而且重现性好，受实验条件和仪器操作条件的影响很小。将本方法应用于毕赤酵母胞内代谢物浓度的绝对定量分析，成功获得了胞内各种代谢物的浓度水平，为后续深入研究毕赤酵母代谢调控机理，实现外源蛋白的高效生产奠定了基础。 　　关键词超高效液相色谱三重四极杆质谱； 1C同位素标记； 代谢物浓度； 毕赤酵母 　　1引言 　　毕赤酵母是一种高效的蛋白表达平台，已用于1多种外源蛋白的表达，其表达水平与胞内代谢物浓度紧密相关。掌握毕赤酵母胞内中间代谢物的浓度信息对理解其代谢调控机理，实现外源蛋白的高效