单个核细胞脱离.ppt

实验内容 人外周血单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离与检测技术（讲解） 实验目的 掌握单个核细胞分离及淋转的原理及方法 熟悉淋巴细胞的检测技术 细胞分离纯化的目的 测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。 根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力； Ficoll密度梯度离心法 常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077左右的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）分层液。 红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 实验材料 实验步骤 淋巴细胞分离及检测技术 E花环分离法 免疫细胞功能检测的意义 免疫系统或其他系统的疾病，免疫接种，某些临床措施或外界环境的影响，均可使免疫细胞的数量和功能发生变化。 因此，免疫细胞数量，功能检测，对于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、预防接种的效果评估及环境因素对机体免疫功能影响的判定，都具有重要意义。 * * * * 2007级五年制本科生免疫学实验课 杨 巍 第四次实验课 人外周血单个核细胞分离 比重：1.070 比重：1.077 比重：1.092 Ficoll Ficoll密度梯度离心法 1管/4人 计数液 1支/4人 1ml刻度吸管 1瓶/4人 PBS 1块/2人 计数板 1把/4人 加样器(tip) 1ml /2人 血液 1个/2人 EP管 1台/2人 显微镜 0.5ml /2人 分层液 2支/2人 滴管 数量 试剂 数量 器材 分组：两人一组 1. 加样：吸取1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距1cm处) NOTE：不要打破血液与分层液的界面； 2. 分离：2,000r/min离心17min，离心后管内液体可分为四层; 3. 回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，放入EP管中(NOTE：尽量少吸分层液);加入PBS至1ml，洗涤1次，4,000rpm/min，离心5分钟，弃上清； 4. 计数：用500ul PBS重悬细胞，取10ul加到计数板内，计数。 （NOTE：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数） 5. 调细胞浓度：细胞终浓度为：1×106/ml 。 （NOTE：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以上为淋巴细胞，部分是单核细胞） 示意图 细胞计数方法 查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50) 4 巨噬细胞 淋巴细胞 DC细胞 免疫细胞的分离 ——免疫细胞的分离原理及方法 免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞的总称。 直接参与免疫应答的细胞主要为：T细胞、B细胞、巨噬细胞 ? 一.?? 外周血单个核细胞（PMBC）分离 二.??淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性纯化淋巴细胞亚群） E花环分离法 尼龙纤维分离法 免疫荧光法 流式细胞术(flow cytometry, FCM) 磁珠分离术 免疫细胞的分离 ? 1.??细胞膜脆性：低渗液分离 2.??细胞密度：密度梯度离心法 3. 细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术 4. 细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛 免疫细胞分离的依据 （一）外周血单个核细胞（PBMC）的分离 血中的细胞 单个核 —— PBMC 无核 —— 红细胞 多核 —— 多核白细胞 PBMC的比重——1.075 红细胞 多核白细胞 平均比重——1.092 Ficoll淋巴细胞分层液 比重——1.077 密度梯度离心法分离原理 离心前示意图 稀释的抗凝血 Ficoll分离液 血浆 PBMC（白膜状）1.075 Ficoll分离液 1.077 红细胞、多核白细胞 1.092 离心后示意图 （二）T、B 淋巴细胞的分离 1、单核细胞的去除： （1）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。 （2）L—亮氨酸甲酯去除法 （3）羰基铁吞噬离心法 2、T、B淋巴细胞的分离纯化 （1）尼龙毛柱法 ** 原理：B细胞易黏附在尼龙纤维上