高效液相色谱法测定饮料中山梨酸和苯甲酸并探究流动相最佳.docxVIP

高效液相色谱法测定饮料中山梨酸和苯甲酸并探究流动相最佳分离比 实验报告 姓名： 尼玛旦增 学号：515110910015 同组成员：高夏鑫 一、实验目的与要求? 1、?掌握高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸和山梨酸的原理和方法? 2、?了解高效液相色谱仪的基本结构和使用方法?? 3、?熟悉饮料样品的处理方法???? 二、实验方法与原理? 苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂，能够引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏等。因此国家严格限制其使用量。在本实验中，样品首先经过超声和加热除去二氧化碳和乙醇，然后过滤注入高效液相色谱仪，经反相C18液相色谱柱分离后，紫外检测器230?nm波长处检测。以色谱峰的保留时间定性，色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析。?? ?? 三、实验仪器与试剂? 1、仪器：高效液相色谱仪（LC-20T，日本岛津公司）； LCsolution Multi-PDA色谱工作站（日本岛津公司）；ODs色谱柱（C184.6’250mm,中科院大连化物所）；定量环：20uL；100?ml烧杯若干；?1?ml和100?μl移液枪；离心管若干个；离心管架；容量瓶若干；0.45μm有机相滤膜；过滤器； ?? 2、?试剂?：? （1）?甲醇（色谱纯）；醋酸铵溶液（0.02?mol/L，色谱纯）；流动相分别超声脱气（10?min）?? （2）?山梨酸储备溶液(1.0?mg/ml）：准确称取0.2500?g山梨酸，加去离子水定容至250?ml。?? （3）?苯甲酸储备液（1.0?mg/ml）：准确称取0.2500?g苯甲酸，加去离子水定容至250?ml。 （4）氨水（1+1） 四、实验步骤?: 1、?样品处理?? （雪碧）：吸取20-30?ml碳酸溶液超声5?min，用氨水( 1 + 1)调节 pH 至近中性，加至50mL容量瓶中，经0．45μm微孔滤膜过滤，滤液待分析。??? （小桃汽）：吸取20-30mL饮料，经干过滤后，取后滤液，用氨水（1+1）调节至pH至中性，加至50mL容量瓶中，经0．45μm微孔滤膜过滤，滤液待分析。? 2、?配制标准溶液?? 配制浓度分别为2.0μg /ml、4.0μg /ml、10.0μg /ml、20.0μg /ml、40.0μg /ml 的苯甲酸、山梨酸、混合标准溶液系列，各进样 20μl，上机测定，以四种物质的峰面积对浓度分别计算回归方程。 3、?色谱条件：?? 色谱柱：C18反相键合色谱柱?? 流动相：甲醇-0.02?mol/L醋酸铵溶液（15?:?85）?＆ 5:95 ＆8:92 流速：1?ml/min?检测波长：230?nm? 进样量20?微升? 柱温：30℃ 4、探究最好的分离度：流动相中甲醇与醋酸铵的配比分为三种15:85、5:95、8:92，将2.0μg /ml的混合标准液进样，计算分离度，探究最佳流动相配比。 5、?标准品和样品测定?? （1）?分别进苯甲酸（2.0?μg/ml）、山梨酸（2.0?μg/ml）标准品，确定保留时间。??? （2）将系列标准混合溶液浓度由低到高依次进入仪器，每次20微升。 （3）将处理好的样品进样，记录峰面积和峰高。 五、注意事项? 1、?如果被测溶液含有气泡，对测定和仪器的使用均有影响，因此需要将被测溶液超声加热除去二氧化碳。?? 2?、苯甲酸的灵敏波长为230?nm，山梨酸的灵敏波长为254?nm，在此波长测定时苯甲酸的灵敏度较低。因此波长选择230?nm。?? 3、平衡前用甲醇：水（5:95）冲洗柱子15?min，再用甲醇-0.02?mol/L醋酸铵溶液（5:95）?进行平衡。?? 4、开机顺序：高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、电脑软件。?? 六、实验数据记录及处理： 1. 优化条件---探究最好的分离度： 对同一浓度的混合标准液（40μg /毫升）采用不同流动相配比，所得实验数据如下： 流动相中甲醇与醋酸铵的配比分为15:85 混标物浓度 峰号 峰保留时间/min 峰面积 峰高 峰宽 40μg /ml 1 7.012 2429599 227560 0.335 2 9.639 3847281 284891 0.426 结合分离度计算公式：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)=6.9041 （2）流动相中甲醇与醋酸铵的配比分为5:95 混标物浓度 峰号 峰保留时间/min 峰面积 峰高 峰宽 40μg /ml 1 8.049 2597446 145835 0.447 2 12.717 3796482 143120 0.672 结合分离度计算公式：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)=8.3432 （3）流动相中甲醇与醋酸铵的配比分为8:92 混标物浓度 峰号 峰保留时间/