PCR常规故障分析.pptVIP

PCR常见问题、原因分析及其对策 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 临床PCR检测的常见问题 定量PCR常见问题 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋浓度 dNTPs dH2O 耐热聚合酶 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯 度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓 度 加量过多导致非特异性扩增增加 引 物 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓 度 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少 反应体系对PCR扩增的影响 过高非特异性严重 过低无扩增产物 浓度适当 避免反复冻融 pH值适当 避免污染 pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 反应缓冲液 dNTPs dH2O Mg 2＋浓度 如何选择最合适的DNA聚合酶 PCR用耐热DNA聚合酶 Taq酶 pfu酶 Hotstart Taq酶 混合酶 Taq plus Long Taq Taq platinum 特异性-----基因组扩增、RT-PCR 保真性-----基因筛选、测序、克隆 长片段扩增-----构建基因图谱、测序等