FABP4对THP1单核源性泡沫细胞内胆固醇影响.docVIP

FABP4对THP1单核源性泡沫细胞内胆固醇影响 　　摘要：目的观察并分析脂肪酸结合蛋白4(Fatty acid binding protein, FABP4)对THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇的影响。方法将THP-1单核细胞与佛波酯(PMA)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共同培养，复制泡沫细胞模型，油红O染色检测泡沫细胞的形成。运用FABP4腺病毒质粒(Ad-FABP4)感染泡沫细胞，设立空病毒对照组(Ad-GFP)和正常对照组(control)，采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测泡沫细胞感染Ad-FABP4后其mRNA表达变化；采用酶法测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的含量变化，观察FABP4对THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇的影响。结果油红O染色检测泡沫细胞模型建立成功，qRT-PCR检测发现泡沫细胞感染Ad-FABP4后FABP4 mRNA水平较Ad-GFP组升高了10.37倍(P＜0.05)，差异有统计学意义。采用酶法测定TC、FC、CE含量的变化，发现与正常对照组比较，Ad-FABP4组泡沫细胞内TC和CE含量分别升高0.69倍和4.06倍，差异有统计学意义(P＜0.05)，FC含量无明显改变。结论 FABP4可能参与THP-1单核源性泡沫细胞内胆固醇沉积过程。 　　关键词：泡沫细胞；脂肪酸结合蛋白4；总胆固醇；游离胆固醇；胆固醇酯 　　动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一类以脂代谢紊乱为主的多基因复杂性疾病，发病率高，危害性大，目前尚无有效的治疗方法[1]。泡沫细胞是动脉粥样斑块的主要成分，也是早期AS的一个典型病理特征[2]。脂肪酸结合蛋白4(Fatty acid binding protein，FABP4)是一类分子量较小且对脂肪酸有高亲和力的可溶性载体蛋白，广泛参与脂肪酸的吸收、转运和代谢[3]。研究发现，在ApoE-/-鼠同时敲除FABP4基因能明显减少AS形成，提示FABP4与AS密切相关[4]。然而，FABP4是否对单核源性泡沫细胞内胆固醇有影响尚未见报道。本实验通过使泡沫细胞感染腺病毒FABP4后，观察并分析FABP4过表达后对单核源性泡沫细胞内胆固醇的影响，探讨FABP4在泡沫细胞形成过程中的作用机制。 　　1资料与方法 　　1.1仪器和试剂超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；相差显微镜(日本Nikon公司)；CO2培养箱(德国Heraeus公司)；荧光定量PCR仪(上海Funglyn)；Mode l680型全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)。THP-1单核细胞株(本实验室冻存)；RPMI-1640培养基(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；佛波酯(PMA) (Sigma公司)；ox-LDL(广州奕源生物科技有限公司)；油红O染色试剂盒(南京建成生物研究所)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均(北京天根生化科技有限公司)；总胆固醇(TC)试剂盒、游离胆固醇(FC)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。 　　1.2 THP-1单核源性泡沫细胞培养THP-1单核细胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置37℃、5% CO2培养箱传代培养，以4×106个/mL细胞接种于25cm2培养瓶，加入含有终浓度为500 nmol/L PMA的RPMI-1640培养基培养48 h，显微镜下观察细胞呈贴壁状态，弃去旧培养液，更换为含终浓度为50 mg/L ox-LDL的RPMI-1640培养基继续培养48 h，用于后续实验。 　　1.3泡沫细胞油红O染色将最终培养好的细胞用PBS缓冲液洗三次，10%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油红O染色10 min，60%异丙醇分色3 min，双蒸水洗5 min，苏木素染色1 min，双蒸水洗待干后用水性封固剂封片，显微镜下观察，细胞内脂质呈红色，细胞核呈蓝色，即泡沫细胞形成。 　　1.4腺病毒FABP4感染泡沫细胞将状态良好的单核细胞在6孔板中每孔接种1×105个细胞，使用PMA和ox-LDL分别刺激48 h后使其分化为泡沫细胞，将细胞分为两组，每组3个孔，按照病毒量MOI=50，分别添加80 μL滴度为1×108的FABP4腺病毒载体(Ad-FABP4)和对照病毒载体(Ad-GFP)；感染2 h后换液，继续培养48 h行后续实验。 　　1.5荧光定量PCR检测泡沫细胞感染腺病毒FABP4后其mRNA表达改变收集细胞，使用RNA提取试剂盒提取细胞RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。通过primer 5软件设计FABP4荧光定量PCR引物：上游引物：5-CCTTTGT