α硫辛酸上调HO1表达发挥对脓毒症急性肺损伤大鼠保护作用.docVIP

α硫辛酸上调HO1表达发挥对脓毒症急性肺损伤大鼠保护作用 　　摘要：目的：探讨α-硫辛酸（α-lipoic acid，ALA）对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用的分子机制。方法：将大鼠随机分为5组：正常组、模型组、ALA干预组、氯血红素（Hm）组以及锌原卟啉（ZnPP）组。给药后进行肺组织的形态学观察，并测定丙二醛（MDA）的含量以及血红素氧合酶-1（hemeoxygenase，HO-1）的活性；RT-PCR检测HO-1 mRNA和蛋白的表达情况。结果：采用手术方法成功复制出脓毒症急性急性肺损伤模型，同时，肺组织中MDA含量、HO-1蛋白活性、HO-1 mRNA水平均高于阴性对照组（P均0.05）；ALA和Hm干预组肺组织损伤程度、MDA含量低于模型组。而HO-1抑制剂ZnPP处理后肺损伤程度、MDA含量高于LPS组（P0.05）。结论：ALA对脓毒症急性肺损伤的保护作用可能通过增强HO-1活性、上调mRNA表达水平而实现的。 　　关键词：脓毒症急性肺损伤；ALA；血红素氧合酶 　　脓毒症（sepsis）是由感染所引发的全身炎症反应综合征，是ICU入住患者的首位死因。目前认为ALI本质是一种肺内过度性、失控性的炎症反应，中性粒细胞于肺内大量聚集是ALI的基本病理特征。因此，针对促炎/抗炎反应失衡的方向和程度，采取不同的干预措施，恢复双方动态平衡是防治ALI的关键。α-硫辛酸（α-lipoic acid，ALA）是一种硫氰化合物，天然存在于人类日常饮食的食物、动物组织以及植物中。研究显示，ALA可抑制巨噬细胞/Kupffer细胞促炎症细胞因子、NO以及ROS的产生而发挥抗氧化和抗炎症活性[1]。本研究旨在探讨ALA对脓毒症诱导的ALI中发挥保护作用的分子机制。 　　1材料和方法 　　脓毒症急性肺损伤大鼠模型的构建及分组 　　雄性SPF级SD大鼠（体重200g～250g）购自南华大学实验动物中心。动物随机分为5组：①对照组（或假手术组）：SD大鼠用10%水合氯醛生理盐水麻醉（400mg/kg），沿前腹正中线作3cm长的切口，取出盲肠，然后逐层关腹。②模型组：取出盲肠后，用4.0丝线在距盲端1. 5cm处结扎，用18号针头在盲肠结扎处远端队穿刺2次，挤出少量粪便，随后将盲肠回纳入腹腔中，逐层关腹。③～⑤CPC干预组：术后2h分别予20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg CPC（Sigma-Aldrich）腹腔注射，12h后给予第二次注射。72h后处死大鼠用于下一步研究。 　　肺组织MDA的测定 　　大鼠安乐死后，取各组右肺下部，获得湿重，然后在烤箱内60℃放置48h，获取干重。计算肺湿/干比值。MDA含量的测定按试剂盒提供的步骤分别加入测试样品及试剂，混匀后95℃水浴40min，4000r/min离心10min，测定上清中OD值（波长532nm），结果以nmol/ml表示。 　　肺组织HO-1活性检测 　　取肺组织加入5体积冷蔗糖Tris﹒HCl缓冲液（pH 7.4）制备组织匀浆，4℃ 13 500 g离心20 min，弃沉淀；上清液15 000 g离心60 min。所获得的微粒体悬浮于100 mmol/L磷酸钾缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA，pH 7.4）中，制成微粒体悬液，用考马斯亮兰法测蛋白含量。HO-1的活性测定按参考文献提供的方法进行[2]。 　　RT-PCR检测HO-1 mRNA的表达 　　用Trizol试剂从处理的细胞中提取细胞总RNA，使用AMV逆转录酶和随机9聚体合成第一链cDNA。HO-1和β-actin（内对照）的引物为：HO-1（309bp）：5’-CTTTCAGAAGGGTCAGGTGTCCA-3’（上游）和5’-CTGAGAGGTCACCCAGG TAGCGG-3’（下游）。β-actin（224bp）：5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3’（下游）。PCR反应结束后取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、拍照。 　　1.1统计学分析 　　采用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量资料用 ±S表示，组间比较采用one-way ANOVA分析后行Student-Newmen-Kuels q检验。P0.05表示统计学差异有统计学意义。 　　2结果 　　1.1肺组织MDA含量的变化 　　模型组肺组织中MDA含量高于对照组（P0.05），两者分别为（11.63±2.71）μmol/ml和（68.37±1.98）μmol/ml。ALA处理后，MDA含量降至（24.18±5.37）μmol/ml （P0.05）：Hm处理组MDA水平也低于模型组，但ZnPP组MDA含量进一步增高。 　　1.2肺组织中HO-1活性改变情况 　　药物处理6 h和1