第3讲节微生物基因操作技术(下).pdfVIP

第三章第三章 微生物的基因操作技术微生物的基因操作技术 3.1 基因定点突变(site-directed mutagenesis).  通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变 所编码的氨基酸序列，用于研究某个 （些） 氨基酸残基对蛋白质的结构氨基酸残基对蛋白质的结构、、催化活性以催化活性以 及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA 调控元件特征序列、修饰表达载体、引入 新的酶切位点等。 图图11--11寡核苷酸寡核苷酸 介导的DNA突 变技术  目前，主要采用两种PCR方法，  重叠延伸技术  大引物诱变法，  在基因序列中进行定点突变。 图1-2重叠延伸介 导的定点诱变 大引物诱变法示意图 PCR介导的定点突变方法的优势  1.突变体回收率高  2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引 入突变入突变  3.可在同一试管中完成所有反应  4.快速简便 3.2基因敲除技术  3.2.1基本原理  经典遗传学 （Forward genetics）是从一个 突变体的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。  现代遗传学 （Reverse genetics，反向遗传 学）首先从基因序列出发，推测其表现型， 进而推导出该基因的功能。  基因敲除 （gene knock-out）又称基因打靶， 通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组， 进行精确的定点修饰和基因改造，具有专 一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定 遗传等特点。  基因敲除分为  完全基因敲除：是指通过同源重组法完全  消除细胞或者动物个体中的靶基因活性  条件型基因敲除：（又称不完全基因敲  除），是指通过定位重组系统实现特  定时间和空间的基因敲除。  噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gi 系统、酵 母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段 常用的四种定位重组系统常用的四种定位重组系统，，尤以尤以Cre/LoxpCre/Loxp系系 统应用最为广泛。 1. 完全基因敲除 图6-9用取代型 （a ）或插入型 （b） 载体进行完全基因敲除实验 图6-10正负筛选法 （PNS法）筛选已发生同源重组的细胞  由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的重组概率约为10-2～10-5 ，植物的概 率为率为1010-4～～1010-5 ，，即使采用双向选择法也很即使采用双向选择法也很 难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发 生了同源重组的胚胎干细胞，得用多种分 子筛选技术验证所获得的确实是目的基因 被敲除的细胞系。 2. 条件型基因敲除  ①构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标 记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要 功能域两侧内含子中插入同向LoxP位点。  ②②需要消除靶基因活性时需要消除靶基因活性时，，与带有与带有CreCre重组酶基因重组酶基因 的ES细胞杂交，Cre可把两个LoxP位点间的DNA片 段切除，导致靶基因失活。也可用Cre表达质粒转 染中靶ES细胞，通过重组将两个LoxP位点间序列 删除 （包括neo基因）。 利 Cre ／LoxP实现靶基因的切除原理 3.3蛋白质及RNA相互作用技术  3.3.1酵母单杂交系统 （Yeast one-hybrid  system ）  是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋 白质之间相互作用的新技术，可识别稳定 结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究 真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用， 并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作 用蛋白的编码基因。  将已知顺式作用元件构建到最基本启动子将已知顺式作用元件构建到最基本启动子 （（minimal promoterminimal promoter，，PminPmin））的上游的上游，，把报把报 告基因连接到告基因连接到PminPmin下游下游。。