一种新植物泛素结合酶体外泛素化检测方法.docVIP

一种新的植物泛素结合酶体外泛素化检测方法 　　摘要：泛素结合酶是一类在泛素化修饰过程中起重要生物化学功能的蛋白。对于被预测为泛素结合酶的蛋白进行体外泛素化活性检测，是确定其泛素结合酶功能必不可少的试验步骤，试验结果可以为后续研究提供重要的线索。目前体外泛素化反应存在体外表达纯化蛋白工作量大、反应复杂、假阴性率高等问题。本研究针对以上问题进行了改良，开发出一种新的植物泛素结合酶活性体外检测方法，该方法无需裂解细胞提取、纯化蛋白，也不需要做体外反应，简便易行，结果更稳定可靠。应用该方法对花生泛素结合酶AhUBC34和盐芥泛素结合酶TsUBC33进行了检测，结果证明这两个蛋白都具有泛素结合酶活性。 　　关键词：泛素结合酶；体外泛素化检测；检测方法；花生；盐芥 　　中图分类号：S18：Q55文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0120-05 　　Abstract The ubiquitin-conjugating enzymes play key biochemical roles in the ubiquitination modification. The in vitro ubiquitination assay is essential to the study of the predicted ubiquitin-conjugating enzyme， which supplies important clues for the following study. So far， the in vitro ubiquitin-conjugating enzyme activity analysis needs huge amount of works such as protein expression and purification. The process is complex， and the ratio of false negative is high. In this study， we developed a new system to detect the plant ubiquitin-conjugating enzyme activity which omits the protein purification and in vitro reaction steps in the old method. This new system is more convenient and stable. We applied this system to detect Arachis hypogaea UBC34 and Eutrema salsugineum （Thellungiella salsuginea） UBC33， and proved the ubiquitin-conjugating enzyme activity of these two proteins. 　　Keywords Ubiquitin-conjugating enzyme； In vitro ubiquitination assay； Assay method； Peanut； Eutrema salsugineum 　　泛素（ubiquitin，Ub）介?У?26S蛋白酶体系统通过参与降解生长发育中不正常的蛋白为生物提供足够的氨基酸供应，并通过降解一些限速步骤的蛋白来精确调节生物的生理过程，为生物生长发育以及应对外界环境的变化提供便利，对生物维持正常的生理功能非常重要。泛素介导的26S蛋白酶体降解途径中主要参与分子包括泛素、泛素活化酶（Ub-activating enzyme）E1、泛素结合酶 （Ub-conjugating enzyme）E2、泛素连接酶 （Ub-protein ligase）E3、26S蛋白酶复合体（26S proteasome）以及去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUBs）。泛素化过程是以上几种酶协同作用的结果。首先，泛素的C末端甘氨酸残基在ATP存在的情况下被E1激活，激活的泛素通过硫酯键结合到E1的一个半胱氨酸上；然后激活的泛素再被转移到E2蛋白的活性半胱氨酸残基上；随后在E3的作用下E2上的泛素共价结合到靶蛋白赖氨酸残基上；这个过程不断重复形成多泛素化蛋白。多泛素化的蛋白经过26S蛋白酶体进行降解，成为单个的氨基酸残基，同时去泛素化酶把多泛素链拆解成单个的泛素，重新进行利用[1]。其中泛素结合酶是一类在26S蛋白酶体降解途径中起重要生物化学功能的蛋白[2]。目前的研究表明，泛素结合酶是多泛素链组装的关键因子，控制了泛素链的起始和延伸，