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一种新的西瓜果斑病种子带菌检测方法 　　摘 要：通过采用病原菌分离、培养基富集培养与PCR技术建立了一套西瓜果斑病菌检测方法。结果表明，MOPS缓冲液对西瓜种子所带病菌分离效果最佳，且利用WFB1/WFB2引物对富集到的病菌进行PCR检测，都产生了预期360 bp片段;对 BFB纯菌液和模拟带菌种子浸提液的最低检测限为1.0×102 cfu/mL。利用OD值法结合平板涂布记菌落数方法绘制西瓜细菌性果斑病病原菌浓度梯度标准曲线：Y=3.984 1x+0.088 1，R2=0.9991（Y×108 cfu/mL）。该检测方法的建立，为西瓜生产中果斑病防治提供了重要技术支持。 　　关键词：西瓜;细菌性果斑病;种子;检测 　　瓜类细菌性果斑病（Bacterial Fruit Broth，BFB）是一种由西瓜嗜酸菌西瓜种（Acidovorax citrulli）引起的严重的世界性种传病害[1，2]。经KB培养基分离培养的细菌性果斑病菌的菌落为乳白色、圆形、光滑、金缘、隆起、不透明，菌落直径1～2 μm，在365 nm紫外线照射下，菌落不发亮，即不产生荧光色素，对光观察菌落周围有透明圈[3]。瓜类细菌性果斑病分别被农业部（2006年）和国家质检总局（2007年）列入我国规定的检疫性病害之一[4]。瓜类细菌性果斑病主要为害葫芦科植物，如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等，自报道以来已经在山东、内蒙古、甘肃、新疆、海南等省发生，给当地的西瓜种植业造成严重的损失[5，6]。 　　细菌性果斑病主要通过种子远距离传播[7]，病菌在种子中的存活时间较长，且抗逆能力强，主要存活在种皮下的胚乳表层[8]，因此在生产中使用健康无菌的种子是防止细菌性果斑病发生和传播的关键。 　　当前国内对细菌性果斑病的检测方法主要采用半选择性培养基、ELISA、PCR及实时荧光定量PCR法等技术。ELISA法应用最普遍，Walcott等[9]利用Elisa法检测了西瓜种子带菌情况，其灵敏度为 　　105 cfu/mL，但不能区分与果斑病菌同属的其他亚种;熊亮斌等[10]建立改良DAS-Dot-ELISA法检测瓜类细菌性果斑病菌，检测灵敏度为1.9×105 cfu/mL;冯建军等[11]利用TaqMan 探针实时荧光定量PCR检测瓜类细菌性果斑病菌，其灵敏度达103～104 cfu/mL;Ha等[12]将磁珠捕获法和多通道实时荧光定量PCR 相结合，可检测到5 000粒种子中存在一粒带病种子。但由于实时荧光定量PCR所需仪器耗材成本较高，且成本低的半选择性培养基法的检测灵敏度较低，因此在实际生产中需要建立一套灵敏、快速且特异性较高的检测方法。本研究在已有检测方法的基础上，采用病原菌分离、培养基富集培养与PCR技术相结合，建立一套病原菌分离-富集培养-PCR鉴定检测体系，以期为生产中检测西瓜种子果斑病带菌情况奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试材料 　　供试品种：华欣西瓜种子（北京京研益农科技发展中心生产）。供试菌株：西瓜果斑病Pslb27菌株（由中国农科院植保所赵廷昌提供）。供试培养基为KBA培养基（蛋白胨20 g、硫酸镁1.5 g、磷酸氢二钾1.5 g、甘油10 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL、pH值7.0）（以上试剂均购自北京鼎国生物技术有限公司）。 　　1.2 仪器与试剂 　　PCR仪为东胜创新生物科技有限公司EDC-810，紫外-可见分光光度计为上海精科UV759，凝胶成像系统为UVP BioDoc-It（美国）。PCR反应体系中10×PCR buffer、dNTPs、10×Taq buffer、Taq DNA聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司。 　　1.3 细菌性果斑病病原菌浓度梯度标准曲线的绘制 　　在KBA平面培养基上培养Pslb27病原菌菌株，挑取生长良好的病原菌单菌落在液体KB液体培养基中，28℃下220 r/min摇菌过夜（16～18 h）至细菌指数生长期，将菌悬液用KB培养基梯度稀释6、8、10、12、14、16、18倍，利用紫外-可见分光光度计在波长600 nm下测定OD值，取其OD值在0.2～0.8绘制果斑病病原菌浓度梯度标准曲线。将菌悬液采用涂布记菌落数的方法用KB液体培养基稀释进行平板计数[13]。 　　1.4 果斑病4个梯度病原菌的稀释与接种 　　挑选在KB平板上生长良好的单菌落，在KB液体培养基中28℃、220 r/min培养24 h。用KB液体培养基对菌悬液进行稀释，在波长600下 nm测定OD值使其在0.2～0.8，利用之前绘制的果斑病病原菌标准曲线得出此菌悬液的准确浓度，用KB液体培养基将菌悬液稀释为1×102、1×104、1×106、1×108 cfu/mL 4个