红景天组织和细胞培养及药用有效成分提取研究.pdf

摘要 摘 要 红景天为景天科 (Crasusl~ )红景天属 (Rhodioal)多年生草本药用植物，在 全世界共有90种，主要生长在平均海拔2O)0(米以上的高山地区。我国是红景天的主 产区，共有37种、2亚种、7变种。红景天始载于藏医药学著作 《四部医典》，己有 10)0(多年的应用历史。传统的红景天主要用于治疗肺炎、咳嗽、跌打损伤、烧烫伤 等症，具有清热解毒和燥湿等神奇功效，享有“高原人参”的美誉。近几年研究发现红 景天具有抗氧化、抗疲劳、抗微波辐射、抑制肿瘤等作用，是具有发展前途的环境适 应性药物。2005版 《中华人民共和国药典》正式把红景天从附录中收入到名录中， 突出了红景天药用价值的重要性。大规模人工采挖、恶劣的生长环境、自身的花粉败 育等因素共同导致了野生红景天植物资源濒临灭绝。本论文是在西藏自治区自然科学 基金重点项目2()0(2一66)资助下，以解决红景天资源短缺问题为出发点，通过近 5 年时间系统研究了珍稀名贵红景天的组织培养、细胞培养和有效成分提取，主要研究 结果如下: 首先，对云南红景天、大花红景天、库叶红景天和长鞭红景天四种珍稀名贵红景 天进行了组织培养快繁研究。0.5%有效氯对红景天外植体表面灭菌25~3omin比较合 适。培养基中添加 1一1.smFLPPM可以有效抑制大花红景天外植体内生真菌滋生问 题.采用TDz、BA和NAA的组合或单独处理进行红景天不定芽的诱导，实验表明: TDZ对云南红景天和大花红景天不定芽诱导具有较强的诱导活性，而对库叶红景天 和长鞭红景天效果不显著。90%的云南红景天叶片在添加15m留LDTz的培养基上 平均可诱导出62个不定芽，在添加0.5m创LTDZ和0.5m叭N从组合的培养基上， 大花红景天茎外植体不定芽诱导率达到1X)(%，平均每个外植体可获得81个不定芽; 库叶红景天叶外植体在添加2.5m叭 BA和0.5m叭NAA的培养基上，不定芽诱导 率达 80%，平均每个外植体可诱导出4个不定芽。86.1%的长鞭红景天叶外植体在 添加3m创LBA和0.lm留LNAA的Ms培养基上不定芽诱导个数平均为5.3个。在 建立再生体系的基础上，采用浸没式生物反应器 (商品名:RTIA)进行长鞭红景天 不定芽的生物反应器培养，长鞭红景天不定芽在生物反应器中每升培养基最高可繁殖 650个不定芽，与液体悬浮培养 (602加升)相比没有达到显著性差异，但显著高于 固体培养 (500个/升)和支撑培养 (240个/升)。 摘要 生根培养实验表明:添加0.3m创LBIA的Ms培养基为长鞭红景天最佳生根培养 基，生根率达到87%;库叶红景天不定芽在添加0.5m叭BIA的Ms培养基上生根 率达37%;而云南红景天和大花红景天不定芽生根都很困难.经一个星期炼苗后，长 鞭红景天组培苗移栽成活率达66%，而库叶红景天组培苗移栽成活率很低。 以长鞭红景天的茎和叶为外体植，诱导获得了4个愈伤组织株系cDL，csD，CLL 和CSL，采用薄层层析和HPLC 色谱检测的方法证明了红景天愈伤组织具有合成红 景天贰的能力.正交实验设计表明:N从有利于红景天贰的积累，2，4.D有利于愈伤 组织的生长，BA3(m创L)+NAA0(.lm留L)为红景天贰积累的最佳生长调节剂组合。 红景天愈伤组织生长周期为27d，鲜重为2679.3叭，干重为11.45泌，红景天贰产 量为1800.m叭。培养条件优化表明，以Ms为基本培养基，40叭 的蔗糖为碳源， 60nlM的总氮量，卜1的氮态氮和硝态氮摩尔比为愈伤组织生长和红景天贰积累的最 佳配方。 在红景天细胞液体悬浮培养时，采用星点设计和响应面分析的实验设计方法对生 长调节剂组合进行优化，结果表明:BA(2.98m留L)和N从 (0.23m留L)为最佳生 长调节剂浓度组合;红景天细胞生物量、红景天贰含量和红景天贰产量最大分别达 14.7叭、11.6m昨 和616.3m留9。对红景天悬浮细胞成功地进行了气升式生物反应 器培养，培养81d后生物量达到最大，鲜重和干重分别为3579.叭和512叭:培 养Zld，红景天贰产量达到最大，为1635.m叭Dw。红景天贰的合成与细胞的生长 呈不严格的线形关系，属于部分生长偶联型。 采用超声波辅助提取、热回流提取和微波辅助提取3种提取方法对红景天有效成 分 (红景天贰、总黄酮和总多酚)进行提