第7章第4节分子杂交和印迹技术3LMJ.ppt

* * 1. 蛋白样品的制备(Protein sample preparation) 蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！ 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进行抽提。 一般实际用的比较多的是 RIPA裂解液，配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。 样品提取以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，然后取出部分蛋白定量，其余加入上样缓冲液 100℃充分变性，再分装保存于-20℃ 。 * 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大，大家可以根据具体情况选取。 Bradford法（考马斯亮蓝法） 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。 该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。 Lowry法（Folin-酚试剂法） 福林-酚试剂（Folin-phenol reagent）的显色原理是：首先在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物，该复合物随之将磷钼酸-磷钨酸还原成蓝色复合物。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质量成正比，蛋白质浓度范围约在25～250 μg/mL。 虽然该法是测定蛋白质浓度应用最广泛的方法之一，但其缺点也很明显，专一性较差，干扰物质多（如Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化物、酚类、柠檬酸等），标准曲线的直线关系不特别严格。因此在其应用过程中有很多新的修正。 BCA法（二喹啉甲酸法） 二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法是Lowry测定法的一种改进方法，是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性条件下蛋白质分子中的肽键能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。 BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。 * 取相同质量的细胞裂解液（体积×蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液。电泳样品加入样品处理液后，要经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。至此，电泳样品已准备就绪，可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。 * 2.2 样品处理 取20～50μg总蛋白量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的蛋白样品，按1：1体积比加入2?上样缓冲液，加相同蛋白量体积不同时以1?样品缓冲液配平上样体积后，于95～100℃加热5～15min使蛋白充分变性，保证蛋白质从空间结构变为一级结构。 2.3 上样与电泳 冰上冷却后，把将处理好的蛋白样品按照预定的顺序上样到SDS胶加样孔内中。注意的是加样孔有多时，可加入等体积的上样缓冲液，最后记得点上预染蛋白质分子量Marker。预染Marker便于在电泳过程中监测蛋白质分离，也可以在随