第7章第6节生物芯片技术3LMJ.ppt

(入射) 激光束 发射光滤镜 检测透镜 检测器 共聚焦 针孔 荧光束 光束分离器(分光镜) 物镜 支持物 由样品发射的荧光 图14-4 共聚焦扫描示意图 反光镜 样品 放大器 数模转换器 计算机 * * * * 基因芯片技术 基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析(图13-4)。 基因芯片技术主要步骤 * * 将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，加入待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 基本原理：蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。 ——又称蛋白质阵列 (protein array) * * 第四节 蛋白质芯片 最常用的探针：抗体 检测方法：标记检测法、直接检测法 4.不同的McAb可通过机械点涂方式固定在膜性载 体表面. 一、芯片的制作 1.作为探针的多肽(或蛋白质)，可原位合成，也可 先合成后固化。 2.蛋白质芯片的载体常选择膜性材料，如 尼龙膜、 NC膜、聚偏氟乙烯膜等。 3.蛋白质芯片的载体的处理方法与核酸 芯片载体 相似。 * * 1.待检测样品抗原从体液、组织细胞, 或从cDNA表 达文库中提取多肽和蛋白质。 2.若作蛋白质组学研究，应同时制备正常与病变组 织的蛋白质样品。 3.蛋白质样品的标记：采用荧光素(Cy3、Cy5)、放 射性同位素等，也可用酶标法标记。 二、样品的制备 * * 1.标记的多肽样品与探针之间的反应有： 用激光扫描仪、磷光成像仪、质谱仪、酶标仪等检测后,再用相应的软件对获得的信号分析。 三、生化反应 Ag + Ab H + R [Ag-Ab] [ H-R ] 2.反应结束后即行洗脱。 等等。 四、检测分析 * * 第五节 生物芯片在生物医学中的应用 一、基因差异表达谱分析 * * 二、DNA测序 三、基因突变的检测 四、基因诊断 五、药物研究开发 六、蛋白质芯片的应用 一、DNA芯片与基因差异表达谱分析 * * (一)探针的设计与芯片的制作 (二)待测样品核酸的提取、扩增与标记 (三)杂交反应与杂交后清洗 (四)扫描与分析 (五)结果与讨论  cDNA * * (一) 探针的设计与芯片的制作 1.探针的设计--寡核苷酸探针设计原则 (1)完全互补性：对目的基因或相关序列 的保守区而言，PM 探针。 (3)探针的丰度：针对靶基因序列设计多个(3个以上) 寡核苷 酸探针。 (2)高度特异性：对基因家族的某个成员或对不同 生物 种属 的同一基因而言。 (4)单碱基错配：即设计MM(mis-match)探针：作内参照(衡 量探针的特异性)。 (5)设阳性对照：采用看家基因β-actin或GADPH基因作为阳 性对照。 * * 离心 2.探针的制备 (细菌培养平板) cDNA文库 挑取 cDNA克隆 扩增培养(液体培养) PCR扩增 扩增产物电泳 (鉴定含靶序列的克隆) 相应的 PCR产物 + 异丙醇 打印 加 DMSO溶解 挥干乙醇 70％乙醇洗涤 取沉淀 * * (1) 玻片的清洗 4.探针的打印与固化 3. 玻片的多聚-L-赖氨酸预处理 (1)编辑打印程序、探针打印 (2)紫外线照射(使探针与玻片交联结合) (3) 80℃ 烘干固定、室温避光保存 (2) 用多聚-L-赖氨酸处理玻片 NaOH乙醇浸泡振荡至少2 hr；双蒸水反复漂洗。 多聚-L-赖氨酸溶液浸泡振荡15 min~1 hr；双蒸水反复漂洗；离心、45 ℃干燥。 * * 反转录荧光标记： 组织或细胞 抽提 总RNA 分离 mRNA AAA…AAA 3’ oligo dT引物 dNTP, RT-ase 荧光标记 dCTP或… SS-cDNA TTTTTT 5’ (二)待测样品核酸的提取、扩增与标记 * * (Cy3为红色,标记处理组；Cy5为绿色,标记对照组) 后续步骤： 1. 终止反应降解模板(总RNA或mRNA ) ； 2.