实验四-鱼类细胞培养基础知识.ppt

鱼类细胞组培的一些方法： 　　　 （1）组织块固定法 　　　当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养。 （2）机械分散法 　　　此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约一立方毫米耐的小块, 放入底部有一铜网的注射器内, 用手的压力将组织挤出网孔, 最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。 （3）络合剂分散法 　　　目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散, 经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮型细胞系的传代。 （4）酶消化法 　　　该法是目前采用极为广泛的方法, 适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶, 常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同, 又可进一步分为冷消化法及热消化法。 （5）冷消化法 　　　此法是将组织剪成约刀的小块, 然后置一倍体积的胰酶中, 四摄氏度培养。 实验四 动物细胞培养基的配置和原代培养 一 实验项目简介 1、实验学时 6学时 2 实验过程： A动物细胞培养液的配置 B采用组织培养法培养鱼类细胞 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织(或器官)，经消化，分散为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。 三、实验目的 1、掌握动物细胞培养缓冲液、消化液的配置。 2掌握动物细胞原代培养的基本过程。 四、实验试剂 DMEM培养基 胰蛋白酶 Hanks缓冲液 抗生素溶液 牛血清 70%乙醇 去离子水 五、实验用品 器材： 解剖剪、解剖镊、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。 上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好， 六、实验步骤 培养液的配置 1、DMEM培养液的配置：将1袋袋装的干粉溶解于1L去离子水中，加3.7gNaHCO3,溶解，调节PH7.2,过滤除菌，4℃保存。 2、双抗溶液的配置：将青霉素、链霉素溶解于生理盐水中，至青霉素最终浓度为100U/mL。 六、实验步骤 3、D-Hanks缓冲溶液： 称取8gN aCl， 0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4, 0.35gNaHCO3溶解于1000mL去离子水中 ，高压灭菌，4℃保存。 六、实验步骤 鱼类细胞的组织培养法 1．取材： 迅速处死动物，无菌分离肝脏,置D-Hanks液中,冲洗肝脏至灰白色。 六、实验步骤 2.接种、培养：将肝脏剪成1mm×1mm×1mm的组织块,用D-Hanks液洗3次,去掉血细胞,37℃下用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用D-Hanks液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块20～25块。 加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在37℃条件下培养,2h后补充培养液,并翻转培养基继续培养。 六、实验步骤 3．观察 置于37℃培养的细胞．需逐日进行观察．主要观察： (1)培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。 (2)细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。 六、实验步骤 待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养了。