细胞生物学实验-叶绿体与线粒体的分离.pdfVIP

叶绿体和线粒体的分离及活体染色 叶绿体 外膜 内膜 基质类囊体 类囊体 基质 膜间隙 基粒类囊体 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换器，光合作用就是在叶绿体中进行 的，所以在细胞生物学、遗传学、分子生物学中都有很重要的研究地位。叶 绿体由叶绿体外被、类囊体和基质三部分组成，叶绿体含有三种不同的膜： 外膜、内膜、类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。 线粒体 内膜 外膜 嵴 基质 线粒体作为细胞的动力工厂，是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要 场所。线粒体由两层膜包被，外膜平滑，膜向内折叠形成嵴，两层膜之间 有腔，线粒体中央是基质。基质内含有三羧酸循环所需的全部酶类，内膜 上含有呼吸链酶系及ATP酶复合体。 叶绿体和线粒体的分离及活体染色 实验目的： 1. 了解细胞器分离的原理和常用方法 2. 了解细胞器活体染色的原理和常用方法 3. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用 实验器材： 新鲜的菠菜叶、冷冻离心机、荧光显微镜、普通光学显微镜、纱布、烧杯、胶头滴 管、载玻片、盖玻片、刀片、研钵 0.35 M氯化钠溶液、0.01％吖啶橙（Acridine Orange） 小白鼠肝脏、解剖刀剪、冰浴装置、吸管、玻璃匀浆器、冷冻离心机、培养皿 匀浆介质I（0.25 M蔗糖；0.035 M EDTA；0.05 M Tris-HCl，pH=7.4）、匀浆介质II （0.21 M甘露醇；0.07 M蔗糖；0.005 M Tris-HCl，pH=7.4 ；0.001 M EDTA）、0.02% 詹纳斯绿（Janus Green B）in 0.25 M蔗糖、70％酒精 叶绿体和线粒体的分离及活体染色 实验原理： 1、 差速离心（适用于不同沉降速度的颗粒分批分离） 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在 不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法。 一个颗粒在一个固定离心力的作用下的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密 度，也同悬浮颗粒介质的粘稠度有关。 当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大 和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加上转速下再进行离心，又得到第二部分较大、 较重颗粒的“沉淀”及含较小和较轻颗粒的“上清液”，如此多次离心处理，即能 把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心 （2—3次），才能得到较纯颗粒。 差速离心方法较简单，但分辨率不高，沉淀 系数在同一个数量级内的各种粒子 不容易分开，常用于其它分离手段之前的粗制品提取（如细胞和病毒的分离等）。 叶绿体和线粒体的分离及活体染色 实验原理： 2、 密度梯度离心（适用于沉降系数较接近的物质分离的方法） 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度 沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的介 质为蔗糖、甘油等。 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度； 离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、 不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连 续区带。可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。 叶绿体和线粒体的分离及活体染色 实验原理：