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全基因组基因表达分析技术及其在果树上应用 　　摘要：基因表达分析对于揭示基因功能、了解基因间相互关系、阐明植物生长发育过程中的生理生化调控机制起着至关重要的作用。综述了mRNA差异显示、cDNA―AFLP、基因芯片、EST数据分析、基因表达系列分析(SAGE)等全基因组基因表达分析技术的原理特点及在果树上的应用情况，并介绍了利用全基因组基因表达分析技术开展果树研究的思路。 　　关键词：果树；基因表达；基因芯片；表达序列标签；基因表达系列分析 　　中图分类号：S66 文献标识码：A 　　文章编号：1009-9980(2008)03-382-07 　　 　　高等生物基因组中多数基因在表达上具有时空特异性。基因表达分析对于揭示基因功能、了解基因间相互关系、阐明植物生长发育过程中的生理生化调控机制起着至关重要的作用。传统的基因表达分析技术是Northera印迹杂交，通过杂交信号的强弱直接反映出基因表达的强度。结果直观且非常可靠，但是一次杂交实验只能鉴定一个基因的表达情况，且灵敏度也不是非常高。随着聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术的普及，反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerasechain reaction.RT-PCR)技术成为单个基因表达分析的首选方法。与Northern印迹杂交相比，RT-PCR具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、成本低等优点，而且采用多重RT-PCR技术还可以同时分析几个基因的表达情况，此外，采用实时定量RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)还可以估算出基因的转录本数目，能够对基因的表达进行精确的定量分析，所以，实时定量RT-PCR已成为单个基因表达分析的主要方法。 　　生物体内的反应呈网络状，随着基因芯片(genechip)、基因表达系列分析(serial analysis of gene ex-pression，SAGE)、大规模平行信号测序(massively par-allel signature sequencing，MPSS)等技术的出现及GenBank中表达序列标签(expressed sequence tag，EST)数据量飞速增长，人们能够同时监测全基因组的基因表达信息。目前，拟南芥的基因表达分析研究已经非常系统和深入。这为非模式植物的基因表达分析提供了良好的借鉴。作者简单介绍mRNA差异显示、cDNA-AFLP、基因芯片、EST数据分析、SAGE等全基因组基因表达分析技术的原理特点及在果树上应用情况，为科研人员开展果树基因表达研究提供借鉴。 　　 　　1 mRNA差异显示的原理及其在果树上的应用 　　 　　1992年，Liang等在RAPD-PCR和RT-PCR技术基础上建立了mRNA差异显示(mRNA differ-ential display)技术，也称作差异显示RT-PCR(Dif-ferential display RT-PCR，DDRT-PCR)技术。该技术是根据绝大多数真核生物mRNA具有多聚腺苷酸(polyA)尾结构的特点，利用含oligo(dT)的3’一锚定引物(TuMNM为A、C或G，N为A、C、G或T)和5’端的随机引物(长度10 nt)对mRNA进行选择性扩增。12个3’端锚定引物与20个5’端随机引物组合形成的240对引物大约能扩增产生2万条DNA谱带，其中每一条谱带都代表一种特定的mRNA，大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收和鉴定，可以获得差异表达基因的片段。 　　与差别杂交(differential hybridization)和差减杂交(subtractive hybridization)等技术相比，mRNA差异技术显示具有简便、灵敏、可重复性好等优点，因此该技术发明后很快得到广泛应用，成为真核生物基因表达分析一种重要的技术手段。但是mRNA差异显示技术也存在一些不足，主要是由于PCR反应条件不够严谨导致假阳性率高，且有时扩增谱带的强度与基因的表达水平并不相关，再有，mRNA差异显示主要展示的是基因表达模式，不能提供全面的表达分布图。 　　mRNA差异显示技术已被应用到多种果树的基因表达研究中，如Lang等利用mRNA差异显示技术从柑橘中鉴定出8个在叶片中表达的冷适应基因；Thomas等利用该技术研究葡萄试管苗瓶内生根与瓶外生根在基因表达上的差异，结果表明2种环境条件下葡萄苗的基因表达模式是一致的。 　　 　　2 cDNA―AFLP的原理及其在果树上的应用 　　 　　2．1　cDNA-AFLP的技术原理和特点 　　扩增片段长度多态性(Ampli