第2篇 细胞生物学研究方法.ppt

第2章 细胞生物学研究方法 主讲 赵晓 2012.09 通过上一章的学习，我们知道： 工具的改进和方法学上的进步推动着细胞生物学的不断发展。 本章要点： 掌握： 1.显微镜的分辨力。 (理解公式的含义） 2.光学显微镜与电子显微镜的异同点。 （从公式出发理解） 3.细胞培养。 （培养的过程、原代培养与继代培养、单层培养与悬浮培养） 了解： 1.细胞组分的分析方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、显微结构的观察 显微镜是观察细胞显微结构的主要工具，分为两大类： 光学显微镜( Light Microscope )简称光镜 电子显微镜(electron microscope)简称电镜 光学显微镜，包括3部分： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置系统 光学显微镜的结构 光学显微镜由3部分构成: ①照明系统：包括光源和聚光器； ②光学放大系统：由物镜和目镜组成， 是显微镜的主体； ③机械装置系统：载物台、镜座、粗细 调节螺旋 问题： 显微镜的观察能力（观察物象的清晰度），仅与显微镜的放大倍数有关？ 显微镜下观察的物像是否清晰，除了取决于其放大倍数外，还与显微镜分辨力（resolution，R）有关。 分辨力是能分辨物体最小间隔的能力。 一般来说，一定波长的光源不能用以探查比它本身波长短的结构细节，这是一切显微镜的基本限度。因此，光镜的最高分辨极限（limit resolution）受可见光的波长（0.4～0.7μm）的限制。 细菌和线粒体的长径约0.5μm，是光镜下能够观察的最小结构。通常将光镜下所能观察到的细胞结构称为显微结构（microscopic structure），线粒体、中心体、核仁等可以在光镜下观察到，均属显微结构。 表2-1 几种介质的折射率（n） （二）相差显微镜 相差显微镜是一种可以观察活细胞或未经染色的样本的显微镜。 原理：相差显微镜能够改变直射光的相位 ，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差（明暗差），同时他还吸收部分直射光线以增大其明暗反差。 （三）微分干涉相差显微镜 所采用的光源是偏振光，显微图像边缘没有光晕，分辨率较高、立体感强，有明显的浮雕感。 适合观察无色透明的标本（活细胞）。 适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 （四） 暗视野显微镜 日常生活中，人们都有这样的体验，由于光的反射和衍射，可在暗处观察到光线斜射时的尘埃，并且尘埃颗粒似乎体积增大；在光线很强或有衍射存在的情况下则看不出尘埃的颗粒。 根据此原理，如果使光线不直接通过样品而是斜射到样品上，则可在暗视野下观察到样品的细微粒子。 图2-7 暗视野照明方式 暗视野显微镜(dark field microscope)使用了特殊的聚光器（通光孔中央有一个圆形遮光板）将照明光源的中央部挡住，使照明光线不能进入物镜和目镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，使被检物体在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使标本反差增大，分辨率提高，可观察到直径4~200nm的颗粒，分辨率比普通显微镜提高50倍。 （五）激光共焦扫描显微镜技术 由于激光束的波长较短，光束很细，所以激光共焦扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光镜的3倍。系统一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内；系统多次调焦，即可获得样品不同层次的图像即断层扫描图像。这些图像信息储存于计算机内，通过计算机处理可显示样品的三维立体结构。 激光共焦扫描显微镜既可用于观察细胞空间结构，也可用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量观察。 图2-5 激光共聚焦扫描显微镜 （六）荧光显微镜 荧光显微技术也许是目前光镜水平对特异蛋白至等生物大分子定性定位的最有力的工具。 荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图2-3）； 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。 多色荧光显微镜 荧光原位杂交技术 是用标记了荧光