免疫荧光细胞化学技术教材.ppt

免疫荧光细胞化学方法： 直接法、间接法 免疫荧光染色标本制备： 涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片…… 经适当固定后染色，或不固定直接染色。 荧光 (fluorescence) 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。 (2)四乙基罗达明(RB200) 褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。 四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1 特异性染色效价测定--与相应抗原标本染色 2 非特异性染色测定--与相类似抗原标本染色 3 吸收试验---在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原 标本染色，结果无明显阳性荧光。 4 F/P比值的测定方法 F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量， F/P=1-2， 过高------非特异染色增强； 过低------荧光很弱，降低敏感性。 荧光抗体的保存 0-4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性； 小量分装； 真空干燥后更易长期保存。 5 膜抗原荧光抗体染色方法 原理和步骤：直接法或间接法； 适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。 结果：阳性荧光主要在细胞膜上。 六、荧光显微镜检查方法1 荧光显微镜 超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。 荧光显微镜的滤片系统 3 使用荧光显微镜注意事项 (1)应在暗室中进行检查。汞灯点燃5-15min，光源稳定后观察；(2)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜；(3)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱；标本在紫外线照射3-5min后，荧光减弱；最多不超2-3h; (4)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源； 4 荧光图像的记录方法 荧光图像：具有形态学特征、荧光的颜色和亮度 荧光显微镜摄影： 基本同普通显微镜摄影技术 高速感光胶片如ASA200以上或24 ℃以上 半自动或全自动显微摄影系统装置，或CCD与计算机联接， 将图像存在软盘上 缺点：紫外光对荧光猝灭作用大（如FITC标记物，紫外光照射30s，荧光亮度降低50%），曝光速度要求高。 七、非特异性染色的产生产生的原因： （1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物. （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。 （4）制备的免疫血清中混杂抗其他组织成分的抗体。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。  结 束 * * 第四章 免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术 (immunofluorescence cytochemistry) 采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针，检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本，根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的性质并定位，以及利用定量技术测定含量。 荧光抗体法： 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。 较常用 荧光抗原法： 用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。 荧光抗体法+荧光抗原法=免疫荧光细胞（组织）技术 免疫荧光细胞化学技术 包括荧光抗体法和荧光抗原法 主要内容 一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜 七、非特异性荧光的消除方法 八、免疫荧光细胞化学的对照染色 一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规