内质网应激在脓毒症大鼠心肌损伤中作用.docVIP

内质网应激在脓毒症大鼠心肌损伤中作用 　　【摘要】 目的：研究内质网应激与脓毒症大鼠心肌损伤的关系。方法：35只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组（n=7）和模型组（n=28），模型组下设2、6、12、24 h 四个时相点 ，每个时相点7只。采用自动生化分析仪检测大鼠血CK-MB及cTnI水平。采用HE染色检测心肌损伤情况，免疫组化技术检测心肌组织ERS标志物GRP78蛋白表达。结果：（1）模型组大鼠6、12、24 h血清CK-MB及cTnI均较对照组显著升高（P0.05）；各时相点病理改变明显；（2）心肌组织中GRP78蛋白表达在2 h即较对照组升高，并呈逐渐增加趋势（P0.05）；（3）GRP78表达与心肌损伤具有显著正相关（r=0.711，P0.05）。也与血清cTnI水平呈显著正相关（r=0.612，P0.05）。结论：脓毒症启动了ERS，并且ERS与心肌损伤、血cTnI水平呈正相关关系。ERS可能在脓毒症大鼠心肌损伤中起重要作用。 　　【关键词】 脓毒症； 内质网应激； GRP78； 心肌损伤 　　doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.16.005 　　脓毒症是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，是机体对感染的一种全身性炎性反应，是严重感染、重度创伤、大手术后、重症胰腺炎和休克等常见的并发症，常导致心、肺、肾、胃肠道、血液系统等重要器官损伤，其中心肌损伤无疑具有至关重要的作用。而关于脓毒症所致心肌损伤的机制，目前已知的有氧化应激、细胞凋亡、NO水平失调等[1-2]，近年有研究表明，内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress ERS）[3]可能参与其中，而GRP78蛋白是ERS的经典标志物。本研究旨在观察脓毒症大鼠GRP78蛋白的变化规律及与心肌损伤的关系，为ERS在脓毒症发病过程中的作用奠定实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠35只，质量150～200 g，由大连医科大学实验动物中心提供。采用随机数字表法分为对照组（n=7）和模型组（n=28），其中，模型组按照内毒素注射时间不同再设2、6、12、24 h四个时相点，每组7只。 　　1.2 试剂 脂多糖（Sigma公司），兔抗大鼠GRP78多克隆抗体（Abcam公司），二步法抗兔免疫组化检测试剂盒（DAKO公司）。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 动物模型制备 采用内毒素腹腔攻击制备脓毒症大鼠模型。大鼠适应性饲养24 h后，腹腔注射脂多糖（LPS）1 mg/kg建立脓毒症大鼠模型，对照组大鼠予等剂量生理盐水腹腔注射[4]。 　　1.3.2 标本制备 到达观察终点后，各组大鼠均开胸心脏采血5 ml放入EP管中，以3000 r/min离心5 min，留取血清行心肌标志物检查。取左心室置10%福尔马林中固定6～8 h，常规石蜡包埋，制成3 μm切片行免疫组化检查。 　　1.3.3 心肌标志物检测 采用德国Beckman全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平。 　　1.3.4 GRP78检测 采用二步免疫组化法。心肌石蜡切片制备完成后，常规脱蜡水化，热修复抗原后3% H2O2处理。GRP78一抗（1：1000）4 ℃过夜，HRP标记的二抗室温孵育25 min，DAB显色。以PBS代替一抗为阴性对照。常规封片，镜下观察。根据文献[6]进行阳性评分，评分方法分为4级：0分：无染色细胞或单个表达的细胞；1分：弱表达，阳性率10%～35%；2分：中度表达，阳性率35%～70%；3分：强表达，阳性率70%。每张切片至少观察10个视野[5]。 　　1.3.5 心肌损害病理组织学评分 采用HE染色光镜下半定量评分，以10倍物镜下，随机选取若干视野观察整个左室心肌切面，从心肌变性坏死、出血、间质水肿和中性粒细胞浸润四方面观察心肌病变分布情况并计分，计算每种病变的视野比例（有心肌病变的视野数/镜下观察的总视野数），正常心肌计0分；病变灶性，病变视野比例≤1/4计1分；病变视野比例为1/4～1/2计2分；病变弥散性，病变视野比例≥1/2计3分。每方面的得分求和即为最后计分[6]。 　　1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，进行单因素方差分析和独立样本t检验以及直线相关分析。P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 心肌标志物变化 模型组大鼠2h血清CK-MB及cTnI与对照组比较无明显差异（P0.05）。而6、12、24 h组血清CK-MB及cTnI均较对照组显著升高（P0.05），且呈逐渐增加趋势。见表1。 　　表1 各组血清心肌标志物