细胞工程-第四节细胞培养1011.pptVIP

4.3.1. 原代细胞培养 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。 最接近和反应体内生长特性 Step 2 将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔 Step 3 用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪， Step 4 剪碎组织 Step5 接种组织块 移入培养箱中（注意贴有组织块的一面朝上）， 观察 24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已被污染； 若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养液pH过高； 若培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般显示细胞生长良好。在相差显微镜下观察，若此时见细胞自组织边缘长出。 继续培养3～5日，再换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接，小心挑掉组织块，继续培养3～4天，细胞贴满细胞培养瓶壁时便可进行传代培养。 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 冻存 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 应用低温保护剂和改进冻融方法 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 1 年后，存活率可达80％-90％。DMSO液用培养液配好， 避免因临时配制产热而伤害细胞。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 慢冻程序 细胞复苏方法 （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 4.3.3 常用培养技术 1. 悬滴培养 2. 培养瓶培养 3. 旋转管培养 4. 克隆培养法 5. 细胞同步化培养 4.3.3 常用培养技术 5. 细胞同步化培养 （1）选择细胞同步化： M期细胞震摇脱落法 离心洗脱法 梯度沉降法 4.3.3 常用培养技术 5. 细胞同步化培养 （1）选择细胞同步化： （2）诱导同步化： 血清饥饿 异亮氨酸营养缺乏 DNA合成抑制剂 秋水仙素 4.3.3 常用培养技术 1. 悬滴培养 2. 培养瓶培养 3. 旋转管培养 4. 克隆培养法 5. 细胞同步化培养 6. 动物细胞的大规模培养 消化传代的步骤 消化法传代培养步骤 （2）贴壁细胞的消化法传代 用胰蛋白酶消化传代 a b c d e f 贴壁细胞的消化法传代应注意： 1)适时传代 2)不同细胞的传代要区别对待 3)消化液浓度要适宜 4）次传代的细胞接种数量可适当多一些 4.5 细胞的冻存、复苏和运输 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器 简易程序 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 请观看视频教程！