细胞观察跟分析-细胞工程课程.pdfVIP

细胞工程课程 3.4细胞观察与分析 3.4.1 细胞计数与活力分析 采用血细胞计数法计数，结果以每毫升细胞数表示。可以采用0.1%（生理盐水配制）浓度的结晶紫 染色细胞计数。该染料对死、活细胞均着色，因此能测出细胞总数。 细胞群体中总有一些因各种原因死亡的细胞。总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。由组织 中分离细胞一般要检查活力，以了解分离方法对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了 解冻存和复苏的效果。 台盼蓝染色法 用0.5%浓度的台盼蓝（Trypan blue）（PBS配制）只对死细胞着色，可测定活细胞 数和计算存活百分率。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞；活细胞不被染色，镜下呈无 色透明状。 MTT（甲基噻唑基四唑，Methyl thiazolyl tetrazolium）法 利用细胞内某些酶与特定的试剂发 生显色反应测定细胞相对数和相对活力。四唑盐是一种接受氢离子的染料，活细胞中琥珀酸脱氢酶能将 四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨（Formazan)，并沉淀在细胞内和细胞周围中。甲暨是含 H N—N=CH—N=NH结构的化合物的总称。甲暨结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中琥珀酸 2 脱氢酶消失，不能将四唑盐还原。还原生成的甲暨结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲 基磺酸钠（pH 4.7）的溶液中溶解，也可以用DMSO来溶解。利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值， 可反映出活细胞数目。细胞活力以活细胞占计数细胞总数百分比来计算。MTT法简单快速、准确，广泛 应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等方面。需要注意的是：MTT法只能测定细胞相 对数和相对活力，不能测定细胞绝对数；MTT粉末和溶液都需要避光保存。 3.4.2 细胞固定与染色观察 细胞固定 细胞除了可直接进行观察外，还可以用细胞固定方法将细胞制成标本进行观察。固定染色观察既可 显示细胞形态，也可揭示细胞的微细结构，是细胞培养中常用的观察技术。 细胞固定常用的固定剂有： （1）甲醇/醋酸：浓度为3：1，现用现配，适用于观察染色体和Giemsa染色。 （2）FAA固定液：80%酒精90.0mL，冰醋酸5.0mL，中性福尔马林(40%甲醛，使用时加过量MgCO 中3 和)5.0mL。 细胞工程课程 （3）Carnoy是较好的非水溶性固定液，含纯酒精60.0mL、氯仿30.0mL、冰醋酸10.0mL，适用于显示 细胞化学成分，但是穿透力较差。 细胞染色 H．E(苏木精一伊红)染色法 H．E染色法是细胞化学染色方法中最常用的一种方法。其基本原理是 用碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变 它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，并能达到良好的核质对比染色。染色过程为：样 品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明和封固等。 Giemsa染色法 Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。Giemsa染 液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，细胞质染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。缓 冲液pH值要准确，否则影响染色效果。用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染 色。染色完毕将标本浸入水中洗除染液。 Feulgen染色法 福尔根(Feulgen)于1924年建立了Feulgen染色法，能对DNA进行特异性染色。 基本原理是：细胞中的DNA在60℃时用1N HCl会解离脱氧核糖核酸，使嘌呤碱基与糖苷键被破坏，嘌 呤碱脱掉，脱氧核糖中的醛基游离，醛基能与Schiff试剂相结合，形成一种紫色的复合物。本方法中 离解是关键，温度过低或酸度不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；反之，酸解过度会导致DNA完全解 聚，染色反应会减弱。细胞中RNA对酸比较稳定，醛基难游离，不被着色，因此染色后，细胞核成粉红 色至紫红色，胞质为无色。 考