流式细胞术 mzyzc.pptVIP

* (1)抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。 (2)Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。 (3)1%多聚甲醛固定样本。 (4)上机检测。 (2)血小板缺陷性疾病 全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病， 如1：巨大血小板综合征，是由于GPIb-IX复合物先天缺陷，导致血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。 如2：血小板无力症，是由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍。 * (3)贮存池疾病 原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。 检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，一次检测的血小板数目有限。 全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断简单、迅速，一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。 常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。 * (4)血小板减少性疾病 破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。 血小板相关抗体（PAIg）是反映血小板的破坏的指标（临床意义仍有争议）。PAIg的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。 流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg，只要测定104甚至103个血小板，在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制备的血小板就足够。 流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C3等。 血小板的生成与巨核细胞有关，全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样，检测分泌到循环中的“网织”血小板，来判断血小板的生成。 * (5)血小板储存与输注 用P-选择素(CD62)、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子标志物，发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象。 储存5天以上，40%～60%血小板表达活化标志CD62。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及β-TG的释放也能反映其活化，但用CD62作为储存血小板的质量控制指标最理想。 活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。 * (6)抗血栓药物的监测 活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗。 也可以监测这些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生。 (7)此外，全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，测定严重血小板减少患者的血小板数目。 * 3、流式细胞仪分析全血中血小板的优点 (1)全血中血小板更接近生理状态。 (2)操作简便，减少操作造成的血小板状态改变。 (3)同时检测血小板的多个标志物，结合FSC和SSC，评估多个参数，进行定量分析。 (4)多采用血小板特异抗体，找出血小板，避免杂质碎片的干扰。 (5)检测血小板亚群灵敏度高。 (6)用血量少。 (7)无放射性污染。 * 4、全血样本的制备 (1)抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。 (2)Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。 (3)1%多聚甲醛固定样本。 (4)上机检测。 * 5、质量控制标本 (1)阴性对照(Isotype Control)：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。 (2)血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。 (3)血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。 (4)血小板表面抗原缺失：如巨血小板症，血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照。 * 6、数据分析——设门： (1)FSC-SSC点图中找出血小板，缺点是血小板较小，不易通过大小将碎片或杂质完全分开 * (2)从CD41或CD61-SSC点图中画出血小板门，由于特异性高，可以有效地去除碎片和杂质的干扰。 * 7.3 细胞凋亡研究 细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。 细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡