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植物基因工程实验技术 编者: 赵 燕 主审: 张学文 南农业大学植物科学实验教学中心 2007 年4 月 前 言 基因工程是现代生物技术的核心，也是现代分子生物学研究的重 要手段。掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要。 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系，本实验指导侧重于DNA 重组操作，将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来，以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导。 为适应基因工程的飞速发展，一些生物技术公司匠心独 ，开发 出专门的试剂盒，使一些复杂的实验操作简单化了。这对于实验者来 说自然是好事，但也使实验者动手胜于用脑。对于实验人员来说，一 定应知其然并知其所以然，才会在实验中 用自己的知识予以创新性 的发展。期望本实验指导不成为实验中的教条。 者 2007 年4 月 1 目 录 实验一 大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存3 实验二 强碱法小量制备质粒DNA5 实验三 琼脂糖凝胶电泳7 实验四 植物总DNA 的提取、纯化和检测9 实验五 DNA 的PCR 扩增 11 实验六 植物总RNA 的分离 15 实验七 RT-PCR 17 实验八 体外重组分子的构建、筛选及检测21 实验九 植物表达 体的构建、筛选及检测22 实验十 植物遗传转化技术23 附录: 实验中常用的仪器与器皿24 2 实验一 大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存 大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种 受体菌，它的遗传背景研究的比较详细，常用做寄主进行基因扩增及外源基因的 表达。 一. 实验目的: 掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。 二. 实验原理: 大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(Plasmid)DNA ， 这是一种双链闭合环状的DNA 分子，大小在1Kb-200Kb 左右，通常质粒DNA 带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些 表现型: 1 ．对抗生素的抗性 2 ．产生抗生素 3 ．降解有机复合物 4 ．产生大肠杆菌素 5 ．产生内毒素 6 ．产生限制修饰酶 pUC19 质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因，它 能 码一种β- 内酰胺酶，这种酶降解氨苄青霉素，从而消除了抗生素对细胞壁 形成的抑制作用，不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。 三．实验材料: E ．coli InvaF E ．coli InvaF (pUC19) 四．实验仪器、器皿及试剂: 仪器:超净工作台 恒温培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 微波炉 器皿:(见附录) 试剂:琼脂 酵母抽提物 胰蛋白胨 Nacl 氨苄青霉素 NaOH 五．实验步骤: 1. 配制培养基： ａ．LB(Lurib-Bertani) media 酵母抽提物 (Yeast extract) 5g/L 胰蛋