酵母双杂交的技术1.pptVIP

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酵母双杂交技术 yeast two-hybrid system 发展背景 酵母双杂交系统是由Fields等在1989年提出的一种在活细胞中鉴定蛋白质相互作用的遗传系统。 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现,许多真核生物的转录因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。 如果要研究两个蛋白之间有无相互作用,可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait), 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告基因(reporter gene)的转录与表达。通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是否存在相互作用。 酵母双杂交操作主要流程 1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞 3. 对酵母转化子进行自激活检测 4. 将重组载体共转化酵母菌细胞 5. 检测报告基因表达产物 6. 分析酵母双杂交实验结果 酵母双杂交技术的优点: 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术,比体外的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。 基于基因重组技术和分子遗传学的原理,更便于观察和检测实验结果。 酵母菌是一种低等真核微生物,能反映真核生物的基本生命现象和规律。 4. 酵母菌生长迅速、容易培养,便于进行高通量、大规模的组学研究。 * * * 酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋白质相互作用的技术。 它可用于: 检验蛋白质间的相互作用; 分析蛋白质相互作用的结构域; 发现新的作用蛋白质。 酵母双杂交技术的原理 基于对真核生物基因调控转录起始过程的认识。 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构,而且也需 要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的BD或AD都不能激活基因转录,但不同转录激活因子 的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 * *

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