5 第五讲1 PCR技术幻灯片.pptVIP

聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction） PCR技术： 概念：通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。 广泛用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。 PCR技术产生的历史背景 1971年，Khorana等人就提出了利用PCR在体外扩增DNA的概念； Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因； 1988年，Chien从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离出耐热DNA聚合酶，简称Taq DNA聚合酶； Mullis正式确定了体外扩增DNA技术，1987年获得专利，命名为Polymerase Chain Reaction (PCR)。 PCR反应的基本过程 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①变性(denaturation) 将模板DNA置于92～96℃处理，使dsDNA链解开成为ssDNA，以便它与引物结合. PCR反应的基本过程 ②退火(annealing) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合成局部双链； PCR反应的基本过程 ③延伸 DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶的催化作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对与半保留复制原理，引物沿5’→3’方向延伸，最终合成一条新的与模板DNA链互补的DNA链。 PCR反应的基本要素 模板DNA Taq酶 dNTP 引物 Mg2+ Template DNA 模板DNA的数量与纯度，是PCR成败与否的关键环节之一。但不同类型PCR反应对模板DNA数量与纯度的要求不同。 数量：3×106个拷贝 酵母菌 10ng 细菌 1ng 质粒 1pg 纯度:RAPD OD260/OD280=1.6～1.9 AFLP OD260/OD280=1.7～1.8 DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 来源：古细菌嗜热水生菌(thermus aquaticus) 特点： ①耐高温，在70℃下反应2 h后其残留活性大于90%，在95℃下反应2 h后为40%； ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶； ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0 kb)； ④具有5’→3’外切酶活性，但无3’→5’外切酶活性，因而对某些单核苷酸错配无校正功能。 pfu DNA Polymerase 来源：是从Pyrococcus furiosis 中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶。 特点： ①它不具有5’→3’外切酶活性，但具有3’→5’外切酶活性，因而可纠正PCR 过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低； ②PCR产物为平端，无3’端突出的单A核苷酸，不能进行T-A克隆。 Vent DNA Polymerase 来源：从嗜热高温球菌(Thermococcus Litoralis)中分离出的。 特点： ①不具有5’→3’外切酶活性，但具有3’→5’外切酶活性，可以去除3’错配的碱基，具有校对功能； ②PCR产物为平端，无3’端突出的单A核苷酸，不能进行T-A克隆； ③PCR产物的扩增长度可达10kb以上。 Primers（引物） 引物：在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DNA片段。 primers 随机引物：引物为随机设计的短序列，通常为10bp左右，扩增产物的非特异性高，易受扩增条件影响； 特异引物：引物根据特定的DNA序列设计而成，扩增产物的特异性强； 简并引物：是根据密码子的简并性原则，以蛋白质序列中的氨基酸保守区反向设计而成的，扩增产物的特异性比较强。 InsuF 5-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3’ InsuR 5-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3 其中 Y= C/T N= A/T/C/G K= G/T