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内蒙古农业大学生物工程学院本科毕业论文(设计) 第 PAGE 4页 引 言 青贮是利用微生物的发酵作用，长期保存青绿多汁饲料营养特性，扩大饲料来源的一种简单、可靠而经济的方法，是保证家畜常年均衡供应青绿多汁饲料，调剂淡季青饲料丰欠，合理利用青饲料的一项有效方法。优质的青贮饲料色泽黄绿且有光泽，气味酸香、柔软多汁，是家畜越冬度春不可缺少的优良饲源。青贮饲料不添加任何动物源添加剂，具有安全可靠、生产条件便利等特殊优点。青贮饲料在微生物发酵过程中产生的乳酸、醋酸及醇类具有酒香味，所以它适口性好，且易消化吸收。 从青贮的发酵机理分析[10]，青贮饲料发酵过程是乳酸菌及多种微生物大量繁殖的过程。如何使其更快地产生乳酸及挥发性脂肪酸（VFA），促进多糖与粗纤维的转化，抑制丁酸的产生，有效提高青贮饲料的品质，是近30年来世界上青贮技术研究的热点。青贮的全过程就是复杂的微生物发酵和生物化学反应的过程，是各类微生物兴衰变化的结果。参与作用的微生物很多，但以乳酸菌为主，青贮饲料调制的成败，主要决定于乳酸生成的过程，其产生越充分，青贮的品质就越好。乳酸菌具有较强的耐酸能力，在青饲料发酵过程中，同型发酵乳酸菌，如植物乳杆菌和短乳杆菌是在乳杆菌中最先出现，在青贮饲料中占有优势。其次能分解糖的梭菌，如丁酸梭菌或酪丁酸梭菌较其它梭菌更耐酸，它们可驱动后发酵，促使丁酸生成，丁酸是青贮变质的一种重要形式。芬兰生物化学家彼尔塔耐（“AIV法”发明者），研究发现甲酸的存在对青贮饲料发酵非常有益，甲酸的存在可以迅速降低pH值，从而促进乳酸菌的繁殖，抑制有害菌的增殖，获得优质青贮。综上所述，监控青贮发酵不同时期各酸的组成，是研究青贮饲料发酵工艺和评价青贮品质的重要技术。 脂肪酸和乳酸也作为饲料的主要酸味剂被广泛使用[6]。它们不仅具有抑制霉菌等有害微生物增殖的作用，而且可减少动物胃肠道中有害微生物的繁殖，同时可降低饲料pH值，激活消化酶，有助于消化吸收某些营养物质，提高饲料转化率，以及为动物提供能量等功能。由于这些酸被完全代谢，并安全无毒而被许多国家批准用于动物饲料的日粮。因此乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）的含量及组成是判断相关饲料品质的重要指标之一，所以精确测定乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）是饲料检验中一项不可缺少的重要分析技术。 目前国内外测定乳酸和挥发性脂肪酸主要是采用气相色谱法[9]，一般方法是乳酸和挥发性脂肪酸分别测定，青贮饲料中的乳酸和挥发性脂肪酸的同时测定未见报道。青贮饲料是多种微生物同时发酵，干扰物质多，分析测定难度大。所以探索一种快速简便且能同时测定青贮饲料中乳酸及挥发性脂肪酸含量的技术有着非常高的实用价值。 目前普遍采用直接进样或苄酯化法和乙酯化法处理白酒、饮料和蔬菜等样品，前者分离效果差，乳酸峰拖尾严重，后者酯化试剂毒性大。我们参考了众多资料应用的实验技术并加以改进，采用简便的甲酯衍生化方法，利用气相色谱填充柱，探索出一种能同时快速测定青贮饲料中的乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）的方法。为青贮饲料的研究提供可靠的分析技术，并可以为有机酸发酵产品的分析测定提供参考。 实 验 部 分 1、实验材料与试剂配制 1.1 实 验 材 料 1.1.1 试 剂 甲酸、乙酸、正丁酸、乳酸为分析纯，丙酸、正戊酸、异戊酸 为化学纯。丙酮、二甲基甲酰胺、四甲基氢氧化铵、碘甲烷均为分析纯。 1.1.2 待测样品 内蒙古农业大学生态学院送来检验的青贮饲料，样1为高活性6g,玉米1kg ； 样2为高活性4g,玉米1kg；样3为盛夏1.5g,玉米1kg；样4为水分70%,玉米1kg。 1.1.3 仪 器 日本岛津GC－9A型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器 1.1.4 色谱条件 色 谱 柱：柱长2m，内径3mm，不锈钢柱 固 定 相：15%的邻苯二甲酸二壬酯与5%的吐温－80混合固定液，担体Chromosorb HP （80~100 mesh）。 温 度：柱温100℃ ,检测器温度：150℃ 气体流速：载气（氮气），30ml/min；氢气，50ml/min；空气，500ml/min 灵 敏 度：102 进 样 量：1μl 纸 速：2mm/min 1.2 试剂配制 1.2.1 标准溶液的配制 ①标准酸溶液的配制：取甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、异戊酸、乳酸试剂适量，分别用蒸馏水稀释至20ml，待标定。 ②标准氢氧化钠溶液的配制：取50% 的氢氧化钠水溶液 8.0g 于 1000 ml 容量瓶中定容，待标定。 ③标准邻苯二甲酸氢钾标定液的配制：取适量邻苯二甲酸氢钾置于110℃烘箱2~3 h,放入干燥器冷却至室温，准确称取0.5g（精确至0.0001g），加入50ml ④四甲基氢氧