沉淀反应在化工中的运用.pptVIP

沉淀反应 信阳职业技术学院 药学与检验系 沉淀反应 沉淀反应——是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反应。 第一节 液相沉淀反应 液相沉淀试验是指可溶性抗原与相应的抗体在含电解质的液体介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物的试验。 类型：絮状沉淀试验、环状沉淀试验、免疫浊度分析。 一、絮状沉淀反应 原理：将抗原抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原于抗体结合，形成絮状沉淀物。 技术类型： 1.抗原稀释法（Dean-Webb 法） 2.抗体稀释法（Ramon 法） 3.棋盘格法（Checkerboard 法) 二、环状沉淀试验 原理：将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面，抗原与抗体在两液交界面处特异性结合，形成白色沉淀环。 Ascoli 1902年创立 方法学评价： 该方法操作简便、快速。敏感性低（3-20mg/L)，只能定性。 主要用于鉴定微量抗原，如鉴定血迹，诊断炭疽。 现在很少使用。 第二节 凝胶内的沉淀试验 凝胶内沉淀试验是将可溶性抗原和相应抗体分别放入凝胶内进行扩散，两者在比例合适的位置形成肉眼可见的沉淀环或沉淀线。 常见的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶。 凝胶内的沉淀试验类型 一、单向扩散试验 1.试管法 2.平板法 二、双向扩散试验 1.免疫电泳 2.对流免疫电泳 3.火箭免疫电泳 4.免疫固定电泳 一、单向扩散试验 1.试管法 1946年Oudin首次报道。将抗血清或纯化抗体混入约50oC的0.7%琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，带凝固后，在凝胶上面加入抗原溶液，让抗原自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环。 本法多用于排泄物和组织均匀浆中的细菌、寄生虫、螺旋体等抗原的检测。 一、单向扩散试验 二、平板法 1.原理：待测抗原从局部含有相应定量抗体的凝胶内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在两者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原的浓度呈正相关。 单向琼脂扩散试验 2.技术要点：将抗体或抗血清混入0.9%的琼脂糖内，未凝固前倾注呈平板，凝固后在琼脂板上打孔（直径约3-5mm），孔中加入抗原溶液，放室温或37oC 让其向四周扩散，24~48后可见孔周围出现沉淀环。 3.数据处理 1.Mancini曲线：适用于大分子抗原和长时间扩散（48h)的结果处理。使用方格计算纸划线，扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。 公式表示：C/d2=K 3.数据处理 2.Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间（24h)扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与扩散圈的直径之间呈线性关系。 公式表示：logC/d=K 4.临床应用 常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等定量测定。 二、双向扩散试验 1.原理：将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，让两者在凝胶内自由扩散，当抗原与抗体相遇，浓度比例适当处形成可见的白色沉淀线。 2.技术要点 将加热融化的琼脂倾注一均匀的凝胶薄层，待琼脂凝固后，在琼脂胶板上打孔，在相对应的孔中分别加入抗原或抗体，置室温或37℃ 18-24小时，观察沉淀线。 3.方法评价 是抗原抗体鉴定的最基本的方法之一。 本试验是一种稳定、简便的方法，不需要特殊仪器设备，重复性好，但灵敏度稍差（1.25mg/L)。 4.临床应用 1.抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估算 出现沉淀线，表明存在相应的抗原和抗体，不出现沉淀线则表明抗原或抗体的缺乏。沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；靠近抗体孔，提示抗原含量较多。出现多条沉淀绒，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，双向免疫扩散可用于鉴定抗原或抗体的纯度。 2．分析抗原或抗体的相对分子量 抗原或抗体在琼脂内扩散的速度受分子量的影响。分子量大扩散慢，扩散圈小，局部浓度则较大，因此形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如二者分子量相等，则形成直线（图16-5）。抗体多为IgG，分子量约150kD，据此可粗略估计未知抗原的分子量。 3．用于抗原性质的分析 两种受检抗原的性质可完全相同、部分相同或完全不同。在一块琼脂板上打三个孔，二个孔中加入抗原，一个孔中加入抗体，扩散后通过沉淀线的形态可鉴定两种抗原的性质（图16-6）。这种技术作为抗原的分析，是免疫化学中较常用的鉴定技术之一。 4．用于抗体效价的滴定 双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗