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第三章 基因工程制药工艺
3.1 基因工程制药微生物表达系统
3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术
3.3 基因工程菌的发酵培养与控制
3.4 重组人干扰素生产工艺
基因工程制药 工程菌种类
基因工程菌:
微生物为操作对象,通过基因工程技术获得的表
达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生
物体。
种类:
细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。
基因工程制药 工程菌种类
3.1 基因工程制药微生物表达系统
3.1.1 大肠杆菌表达系统
3.1.1 酵母表达系统
基因工程制药 工程菌种类
3.1.1 大肠杆菌表达系统
1、大肠杆菌(Eschericlia coli)形态特征
-
细胞:G ,单细胞,杆状。鞭毛,无芽孢,一般
无荚膜。裂殖。
菌落:白色至黄白色,光滑,直径2-3mm。
基因工程制药 工程菌种类
2、生化与遗传特性
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机
盐的极限培养基上生长,发酵糖,产气产酸。
基因工程中使用菌株:K-12株的衍生菌株。
基因组:4.6 Mb,3000多种蛋白质。
染色体DNA为环状双链,核外遗传物质为质粒。
基因工程制药 工程菌种类
3、质粒载体
复制起始点
选择标记
多克隆位点
基因工程制药 工程菌种类
质粒类型
严紧型质粒:在每个宿主细胞只能复制少数几
个拷贝的质粒,pSC101;
松弛型质粒:在每个细胞中能复制几十至几百
个拷贝数的质粒,pMB1和colE1。
克隆质粒:用于克隆和扩增外源基因。
测序质粒:用于基因测序。
整合质粒:用于外源基因与宿主染色体整合。
穿梭质粒:能在两种宿主细胞存在。
表达质粒:能表达基因产物
基因工程制药 工程菌种类
4、产物表达形式
不溶性蛋白质:细胞质内形成包涵体
可溶性蛋白质:存在于细胞质
周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质,可溶性。有
利于分离和减少蛋白酶降解,避免N端附加蛋氨酸。
胞外分泌表达:胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养
液中。
基因工程制药 工程菌种类
5、优点和不足
发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。
具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高(高达70
%),培养周期短,抗污染能力强。
不能用于加工修饰化(糖基化、酰胺化)蛋白表达。
细胞死亡后,细胞壁脂多糖游离出来,形成内毒素,
具有抗原性,产生热源。
N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。
基因工程制药 工程菌种类
6、应用
大量外源基因能超量的表达, 18种药物上市。
多肽类2种(甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽)
激素:胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)
细胞因子类:5种干扰素α (1种PEG化)、干扰素β和
γ,2种G-CSF(1种PEG化),白介素-2、白介素-11、
白介素-1拮抗剂
溶栓酶类:rPA
白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白(疫苗
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