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基于Image J软件肌原纤维蛋白SDS―PAGE优化 　　摘要：采用浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%的SDS凝胶系统，运用Image J软件分析不同蛋白质浓度、pH、NaCl浓度对肌原纤维蛋白的分离效果。结果表明，在蛋白质浓度为1.2 mg/mL、pH为7.5、NaCl浓度为0.5 mol/L时，肌原纤维蛋白中各蛋白质及其亚基实现较好分离，均匀分布于整个电泳条带，且各蛋白条带光密度值能清晰分辨。Image J软件能有效地应用于SDS图像分析。 　　关键词：肌原纤维蛋白；SDS；Image J软件 　　中图分类号：TS254.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4839-05 　　Image J软件是由National Institutes of Health开发的基于Java的图像处理软件，可计算选定区域内分析对象的一系列几何特征。现已广泛应用于植物叶片形态特征描述[1]、金属显微定量分析[2]、针织物孔隙率统计[3]、淀粉表面几何特征分析[4]等场景。目前，Image J软件在电泳图像分析中也有应用，可将蛋白条带数据进行量化，转化为光密度值，解决了肉眼观察的不确定性问题[5]。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）作为一种快速、经济、可重复的蛋白质定性、定量分析及特征鉴定的方法，已广泛应用于各种畜禽肉[6]、水产品[7]、水稻[8]、大豆[9]等农产品蛋白质的分析检测。采用条件适宜的缓冲溶液稀释提取的样品蛋白，并制备电泳样品，利用SDS中网状结构聚丙烯酰胺凝胶所具有的分子筛效应，将不同分子量的蛋白质及其亚基进行分离，从而达到分辨蛋白质的目的。但对于一些极端条件下的样品蛋白，如高NaCl浓度的酱油发酵液、蛋白酶解液等，不能直接运用SDS手段进行分析检测。因此，本试验对肌原纤维蛋白在不同溶液环境（蛋白质浓度、pH和NaCl浓度）条件下进行SDS，采用Image J软件对电泳图像进行数据量化，综合光密度值指标，得到适宜的溶液环境条件范围，为极端条件下的SDS的样品准备提供参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　1 500 g左右的新鲜健康草鱼（Ctenopharyngodon idellus），购于湖北省武汉市武商量贩农科城店。30 min内低温运送到实验室用于提取肌原纤维蛋白。 　　磷酸、盐酸、氯化钠、十二烷基硫酸钠、甲醛、冰乙酸、氯化镁、考马斯亮蓝R-250、G-250，国药集团化学试剂有限公司；过硫酸铵、30%丙烯酰胺Acr-Bis、蛋白上样液、电泳缓冲液、1.5 mol/L Tirs-HCl，武汉科瑞生物技术有限公司；Pre-stained Protein Marker，天根生化科技有限公司（11-245 kDa）；EGTA，美??Biosharp公司；Tris-BASE、0.5M Tris-HCl，美国Dow Chemical公司；四甲基乙二胺（TEMED），美国MYM公司。 　　1.2 仪器与设备 　　F050A片冰机，福建雪人股份有限公司；GL-21M离心机、HI650R离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；722N可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；PB-10 Sartorius pH计，德国Sartorius公司；T18高速均质机，德国IKA公司；DYY-12型电泳仪电源、24DN制胶器、电泳槽、WD-9406型胶片观察灯，北京市六一仪器厂；Universal Hood Ⅱ凝胶拍照系统，美国Bio-Rad公司；SHA-C恒温振荡器，常州国华电器有限公司。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 提取肌原纤维蛋白 参照Wu等[10]的方法，取新鲜草鱼背部肌肉45 g，切碎，加入4倍体积的分离缓冲溶液（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L H3PO4，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH 7.0）高速匀浆30 s后，低温离心（2 000 g，15 min，4 ℃），重复操作2次；取沉淀再用4倍体积0.1 mol/L NaCl溶液高速匀浆30 s，低温离心（2 000 g，15 min，4 ℃），重复操作1次，得到的沉淀即为肌原纤维蛋白，保存于 4 ℃冰箱，48 h内可用。蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法[11]测定。 　　1.3.2 制备电泳样品 不同蛋白质浓度：采用Tris-HCl缓冲液（0.5 mol/L NaCl，pH 7.5）对肌原纤维蛋白进行稀释，获得终浓度为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/mL的蛋白质溶液。 　　不同pH：采用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含0.5 mol/L NaCl）调节肌原纤维蛋白浓度至1.2 mg/mL，然后采用1 mo