基于nano LCLTQOrbitrapMSMS香附四物汤干预原发性痛经模型小鼠卵巢组织差异表达蛋白筛选.docVIP

基于nano LCLTQOrbitrapMSMS香附四物汤干预原发性痛经模型小鼠卵巢组织差异表达蛋白筛选 　　[摘要] 采用nano LCLTQOrbitrapMS/MS蛋白质组学方法筛选鉴定香附四物汤干预原发性痛经模型小鼠卵巢组织中的差异表达蛋白，推测香附四物汤治疗原发性痛经的机制。采用雌激素和缩宫素联合造成原发性痛经模型，给药组连续灌胃给予香附四物汤3 d，于末次给药后1 h，取卵巢，经蛋白提取、变性、还原、烷基化、脱盐、酶解后，进行nano LC分离并在线连接电喷雾串联Orbitrap质谱分析，利用Thermo Proteome discoverer 1.4进行数据处理，筛选并鉴定差异表达蛋白，对差异表达蛋白进行生物信息学分析。随后采用Western blot法，将重要差异蛋白进行验证。正常组、模型组、给药组3组共有的差异蛋白106个，参与细胞过程的蛋白所占比例较大，其所参与的黏着连接、黏着斑等信号通路对细胞内各种信号通路均有调节作用。验证的ADRM1蛋白在模型组中，较正常组表达上调；给药后，较模型组表达下调。通过有效的比较分析，得到一些香附四物汤干预原发性痛经的差异表达蛋白，其中ADRM1蛋白有可能是香附四物汤作用的靶点。 　　[关键词] 香附四物汤； 原发性痛经； 蛋白质组学； 差异表达蛋白 　　原发性痛经（primary dysmenorrhea，PDM）多见于未婚或未育青年女性，发病率高达50%，其中严重影响工作和生活者占10%。中国高校女学生痛经发病率高达60%～80%[1]。由情致变化导致的气滞血瘀证是临床原发性痛经常见证候，生活、工作和周围环境所带来的压力使妇女产生愤怒或抑郁，气机郁滞，血行不畅，导致痛经。香附四物汤是临床经方，其组方药物如当归、香附等在气滞血瘀证痛经治疗中广泛使用。动物、细胞实验证明香附四物汤可改善原发性痛经导致的NEI系统紊乱和激素调节异常[26]。 　　蛋白质组学具有整体性和系统性特点，作为沟通中医药与现代医药2种科学体系的桥梁，为中医药认识疾病的方法、理论的现代科学表征体系提供了适宜的方法[7]。质谱技术是蛋白质组学的核心技术，目前用于蛋白质组学研究的质谱分析器包括离子阱质量分析器（IT）、四级杆（Q）、飞行时间分析器（TOF）、傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）和轨道阱质谱分析器（Orbitrap）[8]。本文基于nano LCLTQOrbitrap平台，对原发性痛经模型小鼠卵巢组织差异表达蛋白进行分析，研究香附四物汤防治原发性痛经的分子机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　雌性健康C57BL/6小鼠，SPF级，体重（20±2）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪 　　1.2 药物与试剂 　　按文献[6]方法制备香附四物汤；动物全蛋白提取试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号BSP003130516]；BCA蛋白质定量检测试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号SK3021130516]；二巯基苏糖醇（DTT，批号C325BA0008），碘乙酰胺（IAA，批号BB13BA0007），碳酸氢铵（NH4HCO3，批号B715BA0021）均购自生工生物工程有限公司；质谱级胰酶（美国Thermo公司，批号QB214128A）。实验用水为MilliQ去离子水。 　　1.3 仪器 　　Dionex Ultimate 3000 UHPLC液相系统（美国Thermo公司）；nanoESILTQVelos OrbitrapElite（美国Thermo公司）；Thermo Acclaim PepMap C18（100 μm × 2 cm）trapping柱；Thermo Acclaim PepMap RSLC C18（75 μm × 25 cm）分析柱；MilliQ超纯水机（美国Millipore公司）；Microfuge 22R高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；真空冷冻干燥机（美国Labconco公司）。 　　1.4 组织样本的制备 　　实验动物分为3组，每组6只，香附四物汤组和模型组按文献方法[9]，通过雌激素和缩宫素联合复制原发性痛经模型，香附四物汤组按含生药6.43 g?kg-1剂量给药，模型组和正常组按同等条件给予等体积的生理盐水，连续灌胃给药3 d，于末次给药后1 h，处死小鼠，解剖，取卵巢，液氮速冻后，贮存于-80 ℃冰箱，备用。 　　1.5 蛋白质组学分析 　　1.5.1 组织全蛋白提取、烷基化、脱盐、酶解 按照试剂盒说明书提取卵巢全蛋白，采用Bradford法测定蛋白浓度。 　　用DTT对蛋白质还原，用IAA烷基化，向还原烷基化后的样品溶液中加入丙酮使蛋白完