基于HNMR当归四逆汤抗凝血作用代谢组学研究.docVIP

基于HNMR当归四逆汤抗凝血作用代谢组学研究 　　[摘要]采用1HNMR代谢组学技术研究当归四逆汤抗凝血作用机制以及对小鼠血浆内源性代谢产物的影响。当归四逆汤灌胃给药1周后，观察当归四逆汤对小鼠凝血酶时间的影响，并采用1HNMR技术分析小鼠血浆代谢指纹图谱，采用主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonalpartialleastsquaresdiscriminationanalysis，OPLSDA），研究给药组与正常组之间的代谢物组差异，筛选与抗凝血作用相关的潜在生物标志物。连续当归四逆汤灌胃给药1周后，能显著延长小鼠凝血酶时间（P0.05）。代谢组学结果显示空白组和复方组能明显区分，与空白组比较，复方组内源性代谢产物肉碱、苯丙氨酸和异丁酸显著上调（P0.01），赖氨酸、组氨酸和胆固醇显著下调（P0.05）。肉碱、苯丙氨酸、组氨酸和胆固醇为当归四逆汤抗凝过程中潜在代谢标志物，当归四逆汤可能通过调节脂质代谢、能量代谢和氨基酸代谢影响血小板聚集功能和组织因子、纤维蛋白酶的表达来发挥抗凝作用。 　　[关键词]当归四逆汤；抗凝；1HNMR；代谢组学；代谢标志物 　　当归四逆汤源于东汉名医张仲景《伤寒论》的经典方剂，由当归、桂枝、白芍、通草、细辛、甘草、大枣7味药组成。现代药理学研究结果表明，当归四逆汤具有抗凝血、抗炎、镇痛、降低血粘度的作用[1]，但从生物体对当归四逆汤复方多成分之整体反应的角度阐释其抗凝作用的机制研究尚未见文献报道。代谢组学主要利用高分辨核磁共振或现代质谱技术，结合模式识别等数值分析方法来研究生物体在生理、病理以及药物和毒物作用下发生的各种代谢物的动态变化[2]，与中医药的整体观和系统论相一致[34]，在现代中药复方研究中具有广阔的应用前景。基于此，本文采用1HNMR代谢组学技术结合模式识别分析技术研究当归四逆汤抗凝血过程中血浆内源性代谢产物的变化，旨在发现其中与抗凝血药效相关的潜在生物标志物，探讨当归四逆汤抗凝作用机制。 　　1材料 　　1.1动物KM小鼠，雌雄各半，体重（25±2）g，由广西医科大学实验动物中心提供，饲养于动物房，温度（24±1）℃，湿度（50±5）%，12h昼夜循环，给予大鼠标准饲料和饮用水。 　　1.2药物与试剂0.9%氯化钠注射液（贵州天地药业有限责任公司，批号；重水（D2O，东京化工厂，纯度99.8%）；3trimethylsilyl2H4propionicacidsodiumsalt（TSP）（青岛腾龙科技有限公司）；当归四逆汤复方组成药材经广西药用植物园莫长明副研究员鉴定为当归Angelicasinensis，桂枝Cinnamomumcassia，白芍Paeonialactiflora，通草Tetrapanaxpapyriferus，细辛Asarumsieboldii，甘草Glycyrrhizauralensis，大枣Ziziphusjujuba。当归四逆汤水提物的制备：按当归四逆汤处方比例称取一定量的药材，加热提取2次，第一次加水6倍量，浸泡1h，常压100℃提取2h，第二次加水4倍量，常压100℃提取1.5h，过滤（200目），合并滤液，于60℃真空浓缩至浓度为1.0g?mL-1（每1mL相当于1g的生药量），于-20℃下保存，备用；凝血酶（北京博奥拓达科技有限公司）；枸椽酸钠（河南君达生物科技有限公司）。 　　1.3仪器RE501型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司），超声清洗器（上海冠特超声仪器有限公司），Mirco17R台式高效冷冻离心机（赛默飞科技有限公司），VarianINOVA600MHzNMR型核磁共振波谱仪。 　　2方法 　　2.1动物分组将健康小鼠随机分为3组，每组15只，分别为空白组、阳性药组（三七伤药片）和给药组（当归四逆汤复方），阳性药组按3g?kg-1灌胃给药，给药组20g?kg-1（1g?mL-1，0.02mL-1）灌胃给药，空白组灌胃等容积生理盐水。每日1次，连续7d。 　　2.2凝血酶时间的测定第7d给药后1h，眼底静脉丛取血，于2mL的离心管中，加入0.1mL2.5%枸椽酸钠溶液，离心（3000r?min-1，15min）取血浆0.1mL，置37℃水浴中，加入凝血酶溶液0.1mL，不断倾斜试管至液体停止流动，记录血浆凝固时间。 　　2.3血浆样品前处理第7d给药后1h，眼底静脉丛取血，于2mL的离心管中，加入2.5%枸椽酸钠溶液0.1mL，离心（3000r?min-1，15min），得血浆0.5mL，于-80℃保存，备用。 　　2.41HNMR血浆样品测定将血浆取出解冻，离心（12000r?min-1，4℃，15min），提取