基于发卡探针DNAG―四链体模拟酶结构转化高灵敏无标记荧光检测DNA.docVIP

基于发卡探针DNAG―四链体模拟酶结构转化高灵敏无标记荧光检测DNA 　　摘 要 建立了基于目标DNA诱导的发卡探针DNA转化为G-四链体DNA过氧化物模拟酶的非标记荧光增强型DNA检测新体系。发卡探针DNA即分子信标探针由两部分构成，环状部分与目标DNA互补，茎部一端由一条富G序列构成。无目标DNA存在时，分子信标处于闭合状态，形成发卡结构； 富G序列由于部分处于杂交状态，无法形成G四链体。当目标DNA与发卡探针DNA杂交并打开发卡结构，富G序列解链并自发折叠成G-四链体结构。G-四链体结构与血红素结合形成DNA模拟酶，催化H2O2还原的同时将无荧光的底物10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪（ADHP）氧化成荧光产物。通过测量荧光信号，实现对目标DNA的定量检测。优化后的体系检测条件为pH 8.0， 10 mmol/L K+， 0.2 μmol/L Hemin， 50 μmol/L ADHP。在优化的条件下，目标DNA在0.005～1.0 nmol/L浓度范围内与体系荧光信号呈线性关系，检出限为3.0 pmol/L。本方法可以区分完全互补和单碱基错配的目标DNA。 　　关键词 荧光； DNA； 发卡探针； G-四链体模拟酶； 结构转化 　　1 引 言 　　近年来，DNA检测在临床诊断、基因变异识别、环境监测、食品安全以及生物学研究等领域的应用愈加广泛，显示出良好的应用前景，引起了研究者的广泛关注[1]。常见的DNA检测方法包括聚合酶链式反应 （PCR） 法[2]、质谱法[3]、光谱法[4]、色谱法[5]、电化学法[6]等。在光谱分析中，荧光法具有操作简单、检测快速、灵敏度高和选择好等优点，是DNA定量检测时应用最广泛的方法之一[7]。 　　分子信标（Molecular beacon，MB）是一种常用的特异性检测目标DNA或RNA的DNA探针[8]。常规的MB茎环结构的两端通常需要标记荧光基团和淬灭基团，在无目标物存在时闭合形成发卡式的茎环结构，淬灭基团通过荧光共振能量转移的方式淬灭发光基团发出的荧光。当目标DNA与MB的环状区特异杂交之后，闭合的茎环发卡结构被打开，发光基团因远离淬灭基团而发出荧光，根据荧光信号的强度来定量目标DNA。得益于发卡状茎环结构，基于MB的DNA检测方法通常具有较高的选择性和灵敏度，但标记过程较为复杂耗时。此外，目标DNA和MB荧光标记分子的1∶1的比例关系也严重制约了基于MB方法灵敏度的提高[9]。因此，开发高灵敏度的免标记MB逐渐引起研究者的关注[10]。 　　近年来，DNA过氧化物模拟酶（DNAzyme）因其表现出过氧化物酶的活性，且具有稳定性好、成本低、易合成、易修饰等优点而成为传感器信号放大研究的热点[11～13]。DNAzyme是富含G碱基的单链寡核苷酸在一定条件下折叠成G-四链体结构，再与血红素结合形成的复合物。利用DNAzyme的催化活性，可以实现多种物质的高灵敏度检测，如金属离子[14]、小分子[15]、蛋白质[16]和DNA[17]等。在大部分过氧化物模拟酶催化体系中，主要采用2，2-联氮基双（ 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二铵盐（ ABTS） 做为酶底物，通过比色法定量[18]。虽然比色分析法简单，但检测实际样品时干扰较多且灵敏度较荧光法低。因而开发基于DNAzyme催化活性的荧光检测体系逐渐引起了研究者的兴趣[19]。 　　本研究设计了免标记的发卡式荧光DNA分子探针，当探针与目标DNA特异性杂交后，发卡结构被打开，探针DNA的一部分会自发形成G-四链体，在血红素存在时表现出过氧化物酶的活性。以无荧光的10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪（ADHP）为模拟酶底物，利用其氧化产物具有荧光的性质实现了高灵敏的DNA检测。2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　UV-2400PC紫外可见分光光度计（日本岛津工公司）； F-7000 荧光仪（日本日立公司）； MIR系列PCR仪（东胜创新公司）。 　　ADHP、30% H2O2、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、TritonX-100（Sigma-Aldrich公司）； 血红素（Hemin）、二甲基亚砜（DMSO）、醋酸钾（Alfa Aesar公司）； 实验用水均为超纯水（≥18.2 Ω?cm）。Tris-HAc（pH 8.0）缓冲液（10 mmol/L Tris，10 mmol/L HAc，0.05%（w/V）TritonX-100）。Hemin 用 DMSO 配成5 mol/L储备液，-20℃暗处保存。ADHP 用DMSO配成20 mmol/L储备液，冷冻保存。使用时用Tris-HAc （pH 8.0） 缓冲液稀释到所需浓度。 　　2.2 实验方法 　　将目标DNA样品溶液加入DNA探针溶液中，在室温下反应