基于分子信标及核酸染料SYBR Green Ⅰ定量检测土壤中汞.docVIP

基于分子信标及核酸染料SYBR Green Ⅰ定量检测土壤中汞 　　摘 要 利用分子信标、单链核酸（ssDNA）及核酸染料SYBR GreenⅠ，通过同步荧光分析法，建立了一种高灵敏、高选择性土壤汞（Hg2+）的定量检测方法。在该体系中，分子信标的荧光基团设计为荧光胺（FAM），分子信标的环设计为与ssDNA互补， 但有4个T碱基错配的序列。在Hg2+存在时，分子信标的环与ssDNA通过“THg2+T”特异性结合形成双链DNA，分子信标的茎被打开，荧光基团与猝灭基团分开，荧光恢复； 同时，核酸染料SYBR GreenⅠ与双链DNA作用，SYBR GreenⅠ的荧光信号显著增强。SYBR GreenⅠ与FAM的最大激发波长与最大发射波长都很接近，通过同步荧光分析法检测时，两种荧光染料的荧光峰重叠，荧光信号增强，可实现Hg2+的高灵敏检测。体系的最优检测条件为：缓冲溶液的pH=8.0，孵育温度为50℃， 孵育4 min， 缓冲溶液中NaCl的浓度为 　　1 引 言 　　汞（Hg）是有毒的重金属元素，在人体中具有累积效应和神经毒性，严重威胁着人类健康[1]。随着工业化、农业现代化及城市化进程的加快，大量的汞通过矿物开采、施肥及空气传播等方式进入农田，而土壤中的汞又通过“土壤植物人”的途径进入人体，对人类健康产生潜在的威胁[2]。 　　目前，定量检测汞的常用方法有原子发射光谱[3]、原子吸收分光光度法[4]、原子荧光[5]、色谱与光谱联用[6，7]及电感耦合等离子体质谱法[8]等。其中，很多方法需要较昂贵的仪器设备，不适合常规检测。 　　核酸染料SYBR GreenⅠ是一种不对称的菁类核酸染料，它本身的荧光信号很弱，与单链DNA几乎不发生作用，但它与双链DNA有很强的亲和性，且与双链DNA结合后，其荧光强度会显著增加。据报道，当核酸染料SYBR GreenⅠ与双链DNA结合后荧光强度会增加800倍以上，是目前所发现的最灵敏的核酸染料之一[9]。基于特异性的“THg2+T”结构对汞的检测方法已多有报道。Ono[10]及Wang[11]等分别基于“THg2+T”的特异性结构建立了高灵敏、高特异性的检测水中汞的方法。此后，各种基于“THg2+T”结构对汞的定量检测，进一步提高了这类方法的灵敏度、选择性及设备的便携性等[12～17]。尽管基于“THg2+T”结构对汞的定量检测方法较多，但方法的灵敏度并不令人满意。 　　本实验利用T碱基与Hg2+能特异性结合形成稳定“THg2+T”结构的特点，将分子信标的环设计成与单链DNA互补且T碱基错配的序列，荧光基团设计为荧光胺（FAM）当分子信标在Hg2+存在时，与富含T碱基的单链DNA通过“THg2+T”结构形成双链，再与核酸染料SYBR GreenⅠ作用，使体系的荧光显著增强。据此建立了一种高灵敏的Hg2+荧光定量检测方法，并将其应用于土壤样品的分析中。 　　2 实验部分 　　土壤样品为黄棕壤，取自湖北恩施白地坪汞矿附近表土（0～20 cm）。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 样品制备 将分子信标及单链核酸C分别溶解在磷酸盐缓冲液中，均配制成2×10 　　Symbolm@@ 7 mol/L的溶液，各取50 μL混合均匀后，再加入50 μL不同浓度的Hg（NO3）2溶液，加缓冲液至总体积为400 μL，50℃孵育4 min，冷却至室温，加入100 μL SYBR GreenⅠ工作液并在室温下反应10 min，然后检测体系的荧光。在所有的实验中，除文中标注或说明外，分子信标及单链核酸的浓度均为2×1Symbolm@@ 8 mol/L，Hg2+的浓度为4×10Symbolm@@ 8 mol/L。 　　土壤样品的消化：称取1.00 g样品，置于消解罐中，加入6 mL王水和4 mL 30% H2O2，密封后将消解罐放入微波炉中加热，升温程序为140℃保持30 min，160℃保持30 min，180℃保持25 min，样品消解完全后自然冷至室温。将样品消解液转移至100 mL容量瓶中，用1% HNO3定容，摇匀待测。在土壤样品中汞的测定及加标回收实验中，均取50 μL的待测溶液，按样品制备方法处理后进行测定。 　　2.2.2 Hg2+的检测 　　将制备好的样品放入比色皿中，用同步荧光分析法对Hg2+进行检测。同步扫描的波长间隔设置为25 nm，荧光分光光度计的激发及发射狭缝宽度均设置为10 nm。 　　3 结果与讨论 　　3.1 方法可行性分析 　　Hg2+的检测原理如图1所示。没有Hg2+时，分子信标的环与ssDNA中有多个TT错配碱基，不能形成双链结构，核酸染料SYBR GreenⅠ只与分子信标的茎（双链部分）作用，由于分子信标双链很短（只有6个碱基对），其荧光信