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基于双重猝灭原理分子信标定量检测凝血酶 　　摘 要 利用G碱基和有机猝灭基团对荧光基团的双重猝灭作用构建了分子信标，建立了一种基于双重猝灭原理的检测凝血酶的简单方法。此分子信标中荧光基团设计为羧基荧光素（FAM），有机猝灭基团设计为Black Hole Quencher 1 （BHQ1），BHQ1连接3个含有G碱基的核苷酸，分子信标的环设计为凝血酶的核酸适配体。体系中没有凝血酶时，分子信标呈茎环结构，荧光基团FAM与有机猝灭基团BHQ1及G碱基相互靠近，FAM的荧光在BHQ1及G碱基的双重猝灭下，其荧光信号很弱； 当体系中有凝血酶存在时，分子信标与凝血酶特异性结合，形成G四联体结构，茎环结构被破坏，FAM远离猝灭基团BHQ1及G碱基，其荧光得到恢复。在最适条件下，体系的荧光强度（ΔI）与凝血酶的浓度（C）在0.4～40 nmol/L范围内具有良好的线性关系，线性回归方程为ΔI=24.63C （nmol/L）+13.06 （R2=0.9972），检出限为0.18 nmol/L （3σ， n=9）。实际血样加标回收率为96.3%～98.7%。 　　1 引 言 　　凝血酶（Thrombin，TB）是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白酶，在人体凝血过程中发挥了重要作用[1，2]。适配体是通过指数富集的配体系统进化技术，经体外筛选得到的能与蛋白质或小分子的特定区域相结合的寡聚核苷酸片段（DNA或RNA），可以特异性地识别相应的靶分子[3～8]。迄今，已筛选到的凝血酶核酸适配体序列有两个，一个是由 15个碱基构成的能识别凝血酶的肝素结合位点的适配体，另一个是由29个碱基构成的能识别凝血酶血纤维蛋白结合位点的适配体[9，10]。目前，这两种凝血酶核酸适配体都已被广泛用于凝血酶的检测[11～14]。 　　分子信标是一种可形成发夹结构的茎环双标记的寡核苷酸探针，具有选择性好、检测速度快以及无需与未反应的探针分离即可实时检测等特点，广泛应用于核酸检测分析[15～17]。目前分子信标在凝血酶的检测中已有应用，但使用的多为传统的分子信标，荧光背景较高，影响了定量分析的灵敏度[18，19]。 　　本研究基于鸟嘌呤（G碱基）对FAM具有较好的猝灭作用[20，21]的原理，利用G碱基和有机猝灭基团对FAM的双重猝灭作用，设计了一种结构简单、合成容易的具有双重猝灭作用的分子信标，稳定性好， 荧光背景信号低， 与凝血酶反应速度快，基于此建立了快速定量检测凝血酶的新方法。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与及试剂 　　RF5301PC荧光光谱仪（日本Shimadzu公司）； 凝血酶（上海麦克林生化科技有限公司（中国））； 牛血清蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）、牛血红蛋白（HB），购于上海邦景实业有限公司； 其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司； 实验所用缓冲溶液为0.1 mol/L TrisHCl ?冲溶液； 所有的分子信标均由上海生工生物技术有限公司（中国）合成，其序列如表1所示。 　　2.2 样品制备及检测 　　将分子信标及凝血酶分别用0.1 mol/L TrisHCl （pH 8.0）缓冲溶液配制成400 nmol/L储备液，并分别稀释成不同浓度的溶液，备用。取50 μL凝血酶溶液加入到50 μL的分子信标溶液中，混合均匀，补加TrisHCl缓冲溶液至500 μL，室温下反应30 min，检测荧光信号。本研究采用同步荧光分析法，因为FAM的最大激发波长与最大发射波长之差（斯托克斯位移）为26 nm，因此实验中同步扫描的波长间隔（Δλ）设置为26 nm，荧光分光光度计的激发及发射狭缝宽度均设置为10 nm。 　　2.3 选择性实验 　　在4份50 μL 400 nmol/L凝血酶溶液中，分别加入50 μL蒸馏水、50 μL 浓度为4×10 　　Symbolm@@ 4 mol/L的牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、牛血红蛋白（HB）溶液，再分别加入50 μL 400 nmol/L分子信标溶液，最后加入TrisHCl缓冲溶液至500 μL，混合均匀，常温下反应30 min后，进行荧光检测。 　　3 结果与讨论 　　3.1 检测原理 　　利用双重猝灭分子信标检测凝血酶的原理如图1所示。体系中没有凝血酶存在时，分子信标呈茎环结构，荧光基团FAM与猝灭基团BHQ1及G碱基相互靠近，FAM的荧光在BHQ1及G的双重猝灭下，其荧光信号很弱； 体系中存在凝血酶时，分子信标的环即凝血酶的适配子序列与凝血酶特异性结合形成G四联体结构，茎环结构被破坏，FAM荧光基团远离猝灭基团BHQ1及G碱基，荧光得到恢复。凝血酶浓度越高，与其结合的分子信标越多，即更多的环被打开，因此体系的荧光信号越强，通过FAM荧光信号增强的程度