法夫酵母胞内_6G_呋喃果糖转苷酶的分离纯化与性质研究_陈静.pdfVIP

摘 要 6 法夫酵母胞内 G-呋喃果糖苷酶的分离纯化及性质研究 学科、专业：制糖工程 硕士研究生姓名：陈静 指导教师：金征宇教授 法夫酵母胞内 6G-呋喃果糖苷酶，在以高浓度蔗糖为底物时，能够生产新科斯糖作 为主要转糖基产物。新科斯糖(neokestose)是一种蔗果三糖族低聚糖，由果糖基 C-2 与蔗 糖分子中的葡萄糖基 C-6 位相连所得，与其他低聚果糖相比具有更好的益生菌功能和稳 定的化学特性。 论文以法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous 269 ）为出发菌株，摇瓶发酵收集 菌体后，对法夫酵母的破壁方法进行了研究。结果表明：高压细胞破碎方法的破壁率为 89.8%，高压均质方法的破壁率达到 87.5%，均明显优于冻融法的 50.1% 。然而，高压均 质法破壁率虽然较高，但是不能进行温度控制，使得酶活性受到影响；而采用高压细胞 破碎仪进行破碎, 蛋白质的含量较高，酶的活力也大大高于其他的破碎方法。 本文对胞内 6G-呋喃果糖苷酶的分离纯化也进行了研究。粗酶液经聚乙二醇（PEG ） 20000 浓缩后，上 DEAE 纤维素 52 阴离子交换柱两次层析得到电泳纯的酶蛋白，总酶 活回收率为 13.4%，比酶活为238.64 U/mg ，比粗酶液提高了 35 倍。经 SDS分析， 6 胞内 G-呋喃果糖苷酶的分子量约为 33 kDa 。 6 6 纯化后的胞内 G-呋喃果糖苷酶的酶学性质研究表明，胞内 G-呋喃果糖苷酶的最适 温度为 45 ℃，最适 pH 为 6.4；在 pH4.0～7.0 的范围内和小于45 ℃时具有较好的稳定性。 Ca2+ ，Li+，Mn2+ ，Ba2+ 和 Al3+对酶具有 1.25−1.4 倍的激活作用，Zn2+对酶活性有较小 的抑制作用，而K+和 Mg2+则没有显著的影响。EDTA 对酶活力有显著的激活作用，而 SDS 则具有明显的抑制作用，残余酶活仅为 65% 。对于胞内6G-呋喃果糖苷酶的转移活 性，米氏常数 Km 和最大反应速率 Vmax 分别为 511 mmol/l、233 μmol/(min·mg) ；水解 活性的 Km ，Vmax 值分别是 62 mmol/l 和 164 μmol/(min·mg) ，其底物抑制的解离常数 877 mmol/l。在40%蔗糖作为底物时，最大 neo-FOS 的产量为73.9g/l 。 工业化过程中生产低聚果糖一般采用粗酶液，为了更好的控制低聚果糖的工业化生 产，对法夫酵母胞内粗酶液的酶学性质进行了研究，结果显示：该酶最适 pH 为 6.4，最 适温度为 60℃；在温度小于 70℃，pH4.0～7.0 范围内，酶具有较好的稳定性。Zn2+和 Mg2+对酶活力有抑制作用，SDS 对酶的抑制作用最为显著，残余活力仅为 64.56% ；Ba2+ ， Al3+对酶活性有较少促进作用。 关键词：胞内6G-呋喃果糖苷酶，Xanthophyllomyces dendrorhous 269 ，酶学特性，新低 聚果糖 I Abstract Using sucrose as the substrate, 6G-fructofuranosidases from Xanthophyllomyces dendrorhous produces neokestose as the main transglycosylation product, a potentially novel bifidogenic trisaccharide. Neokestose with