细胞核蛋白分离方法-Bio-protocol.PDF

/e1010122 DOI:10.21769/BioProtoc.1010122 细胞核蛋白分离方法 Nuclear Protein Isolation Protocol 徐艳，陈香嵩，熊立仲* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：lizhongx@ 引用格式：徐艳，陈香嵩，熊立仲. (2018). 细胞核蛋白分离方法. Bio-101 e1010122. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010122. How to cite: Xu, Y., Chen, X. S. and Xiong, L. Z. (2018). Nuclear protein isolation protocol. Bio- 101 e1010122. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010122. (in Chinese) 实验原理：样品在Buffer A 作用下细胞破裂，释放胞浆蛋白及其他蛋白，离心后所得 沉淀中包含细胞核，再经高盐Buffer 抽提可得到核蛋白。 实验目的：抽提核蛋白可用于PAGE 电泳，Western blot，免疫共沉淀等下游实验， 可排除胞质蛋白及其他蛋白的影响 关键词：核蛋白抽提，高盐buffer，低盐buffer，透析 材料与试剂 注：所有试剂尽量用sigma 进口试剂。 1. 液氮 2. 10 ml/50 ml 离心管 3. 1.5 ml 离心管 4. Miracloth (Calbiochem, catalog number: 475855) 5. 各种型号枪头 6. HEPES (pH 7.8) 7. KCl 8. MgCl2 9. EDTA 10. Sucrose 11. Triton X-100 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010122 DOI:10.21769/BioProtoc.1010122 12. DTT 13. PMSF 14. Glycerol 15. Buffer A (见溶液配方) 16. Low Salt Buffer (见溶液配方) 17. High Salt Buffer (见溶液配方) 18. Dialysis Buffer (透析液) (见溶液配方) 仪器设备 1. 量筒 2. 烧杯 3. 天平 4. 高速离心机 5. 移液枪 6. 振荡器 7. 摇床 8. 磁力转子 9. 磁力搅拌器 10. 计时器 11. 透析袋 实验步骤 1. 液氮磨样。 2. 称5-10 g 粉末，装入预冷10 ml/50 ml tube 中，加入15-30 ml Buffer A ，摇匀，致 混合物呈可流动的粘稠液体。置冰上10 min，间或颠倒。 3. 膜布(Miracloth)过滤，先单层膜布滤一次，再双层膜布滤一次。 4. 将所得上清液4 °C 离心，3,000 x g ，20 min，可见绿色沉淀。 5. 弃上清，用5 ml Buffer A 重悬沉淀，轻柔吸打混匀，转至10 ml tube 中。 6. 4 °C 离心，2,000 x g ，15 min。 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2 /e1010122 DOI:10.21769/BioProtoc.1010122 7. 弃上清，用1 ml Buffer A 重悬沉淀，轻柔吸打混匀，转至1.5 ml tube 中。 8. 4 °C 离心，2,000 x g ，10 min。 9. 弃上清，加180 μl Low Salt Buffer，吸打混匀 (较难吸打)。 10. 加270 μl High Salt Buffer，吸打混匀；若起始样品量较多，此步样品将变得极粘稠， 吸打不动，只能用枪头搅匀。 11. 将样品用冰袋包裹，放振荡器上振30 min；或置翻转摇床上4 °C 摇1 h。 1