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多毛番茄冷诱导转录因子CBF1转化番茄研究 　　摘要：番茄在气温低于12 ℃时即不能正常开花结实，因此番茄生产受到了很大限制。多毛番茄是一种野生番茄，具有耐低温甚至抗冻的特性，短暂遭受0 ℃的低温，仍能正常开花结实。构建了多毛番茄冷诱导转录因子CBF1的植物表达载体，并通过农杆菌介导法转入番茄中，获得8株转基因阳性植株。转基因植株经冷诱导处理后，丙二醛（MDA）含量和超氧自由基（ O-2 ? ）含量均低于非转基因对照，而超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量、过氧化氢酶（CAT）活性、抗坏血酸过氧化物酶（ASA）活性和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性则高于非转基因对照，表明转多毛番茄CBF1基因（ShCBF1）可以提高番茄的抗冷性。 　　关键词：多毛番茄;CBF1转录因子;耐冷性;番茄;遗传转化 　　中图分类号：S641.201 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）04-0030-06 　　收稿日期：2014-05-23 　　基金项目：国家自然科学基金青年项目（编号;教育部科学技术研究重点项目（编号：211043）;黑龙江省博士后基金（编号：LBH-Z12044）;黑龙江省高校寒地蔬菜生物学重点实验室开放课题基金（编号：CVB2012-005）。 　　作者简介：王沛文（1990―），男，内蒙古人，硕士，从事蔬菜分子生物学方面的研究。E-mail：1009934259@。 　　通信作者：王傲雪，博士，教授，从事植物分子生物学方面研究。E-mail：wangaoxue@yahoo. com。 　　番茄是一种重要的蔬菜作物，在世界各地均有栽培，但在生产过程中，经常遭受低温冷害，因而降低了经济效益，影响番茄生产。而多毛番茄是一种野生番茄，属番茄属[1]，相关研究表明，它具有耐低温甚至抗冻的特性[2]。多毛番茄叶片表面有厚密的绒毛，而普通番茄不具备此特点，推测多毛番茄表面的绒毛可能在一定程度上提高了其耐冷能力[3]。然而多毛番茄只有作父本和栽培番茄杂交才能坐果，而且果实结籽率低，转育杂交困难[4]，限制了其作为育种材料的应用。多毛番茄的高耐冷性不仅与膜脂相变程度小、膜结构的调整能快速适应低温、代谢调整等一些生理生化变化有关[5]，同时也受CBF1基因的诱导[6]。 　　CBF（CRT/DRE binding factor）基因是一种抗冷（冻）转录因子，CBF基因首先在拟南芥中被克隆出来[7]。该基因通过调动一系列的冷害相关（COR）基因完成植株的抗冷机制[8]。对多毛番茄而言，它的CBF1基因与普通番茄的CBF1基因同源性很高，但是普通番茄为冷敏植物，不具备耐冷性，多毛番茄耐冷性却很强。推其原因，可能是多毛番茄CBF1基因下游的耐冷相关基因的分布和普通番茄不同，导致多毛番茄CBF1基因对下游基因的调控作用强于普通番茄。 　　在拟南芥中过量表达CBF1基因，植株的抗寒能力明显提高，不仅能提高COR蛋白的含量，而且大幅提高可溶性糖和脯氨酸含量[9-11]。Hsieh等将拟南芥的CBF1基因转入番茄后，使番茄植株的CAT活性增强、脯氨酸含量增加，在干旱条件下比野生番茄植株表现更强的抗旱能力[12]。本研究从具有强抗冷性的野生番茄中克隆得到的CBF1转录因子通过农杆菌介导法转入到番茄中，并探讨了转基因植株的抗冷性及生理生化变化，获得了抗寒力增强的番茄新材料。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 多毛番茄LA1033来自番茄遗传资源中心（tomato genetic resource center，TGRC），普通番茄Micro-Tom由东北农业大学番茄课题组提供。 　　1.1.2 菌株和质粒 PMD18-T载体购自TaKaRa公司（大连）。植物表达载体p（h+p）由东北农业大学生物工程实验室馈赠，大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105由东北农业大学番茄课题组提供。 　　1.1.3 主要试剂 各种限制性内切酶购于大连TaKaRa公司，T4连接酶、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Km）购自 Promega 公司;质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其他试剂均国产分析纯试剂。 　　番茄再生体系利用现有的成熟体系，具体如表1所示。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 引物及PCR反应条件 根据笔者所在实验室已经克隆的多毛番茄LA1033的CBF1基因序列（GenBank 登录号GU129699）设计特异引物，在引物两端添加适当的酶切位点，便于载体构建。引物设计应用primer 5.0软件进行，合成由上海生物工程有限公司完成。ShCBF1up为5′-GT GGATCCACCATG