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分离CACaRop1和DNCaRop1的互作蛋白及亲和差异性的分析.doc

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分离CACaRop1和DNCaRop1的互作蛋白及亲和差异性的分析

实验设计:GST-Pulldown分离CA-CaRop1和DN-CaRop1的互作蛋白,及亲和差异性的分析 一、重组诱饵蛋白的获得(DN-GST, CA-GST) 融合蛋白的诱导表达 一扩,挑取克隆到试管中摇荡培养7h, 二扩,一扩转移500μl菌液到20ml LB培养基中摇荡培养约为1h,至OD值约为0.5~1.0为佳,同时扩上5瓶,保证足够的融合蛋白以备后续实验。 诱导,加入200μl的IPTG,至终浓度为1mM,28℃摇荡诱导培养7h。 取出1ml诱导菌液以及未诱导菌液进行SDS表达验证。 剩余菌液5000*g离心5min,去除培养基,加入5ml裂解缓冲液,混匀后5000*g离心5min,收集菌体,-80℃保存备用。 缓冲液的配制以及细胞的破碎 裂解缓冲液配方:50mmol/L Tris-Hcl pH 7.5, 150mmol/L NaCl, 1mmol/L EDTA 用时加入 0.3mmol/L DTT, 0.1% NP-40 蛋白酶抑制剂。 细胞裂解之前最好先加入裂解缓冲液(1:10,v/v),冰浴30min. 冰上超声波细胞破碎程序: 5s, 9s, 4min 离心15min,收集上清液,冰上备用。 融合诱饵蛋白的亲和挂柱 Glutathione Sepharose4B 珠子的准备: 取出一个干净的层析柱,用剪了头的移液器吸取1ml摇匀了的Glutathione Sepharose4B珠子于柱子中,加入4ml的裂解缓冲液,温和平衡珠子,4℃,1300*g离心30s,去除裂解缓冲液,重复至少5次。因为珠子的平衡程度与蛋白的亲和程度有着直接的关系。 诱饵蛋白与珠子的亲和结合: 将准备好的带GST标签的融合蛋白细胞裂解液加入到准备好的珠子中,冰上温和缓慢摇滚孵育1h,4℃,重力自然过柱,直至所有的细胞裂解液全部过柱。(控制在3h之内) 洗脱 4℃,1300*g 离心30s去除裂解液,再加入4ml裂解缓冲液温和摇滚数次,4℃,1300*g离心去除缓冲液,重复不少于5次,确保杂蛋白去除干净。 辣椒总蛋白的提取及定量分析 植物总蛋白提取缓冲液的配制: 50mM Tris-Cl pH 7.6 50mM NaCl 5mM MgCl 5mM EDTA 1mM DTT NP-40 0.5% Triton X-100 植物蛋白酶抑制剂 植物总蛋白的提取方法:从-80℃中取出辣椒叶片(青枯病处理与未处理,高温处理与未处理),用液氮迅速研磨碎辣椒材料,加入适量的PVPP及1ml提取缓冲液,研磨混匀并转移至10ml离心管中,再加入1ml提取缓冲液,把研钵中的剩余材料转移到离心管中,冰上备用。在每个离心管中加入一定量的蛋白酶抑制剂。 4℃,6000*g离心30min,收集上清液,去除组织残渣。 4℃,最大转速离心30min,收集上清液,冰上备用。 诱饵蛋白与靶蛋白的亲和结合 取出第二步获得的挂着诱饵蛋白的柱子,加入上一步所获得的植物总蛋白溶液,温和翻滚1h,重力自然过柱,直至所有的溶液全部过柱。总的结合反应不要超过5h。 4℃,1300*g 离心30s去除植物总蛋白溶液,再加入4ml植物总蛋白提取缓冲液,温和摇滚数次,4℃,1300*g离心去除缓冲液,重复不少于5次,确保杂蛋白去除干净。 靶蛋白的洗脱 洗脱缓冲液:50 mM Tris/HCl, pH 7.6 10 mM EDTA 1 mM DTT 5 mM MgCl2 500 mM NaCl 在柱子中加入1ml的洗脱缓冲液,温和摇滚数次,4℃,1300*g离心收集缓冲液,冰上备用,重复3次,将收集到的缓冲液集中在一个离心管中冰上备用。 靶蛋白的浓缩及定量分析 洗脱后蛋白的浓缩脱盐:将洗脱液分次加入到浓缩离心柱(3K)上,14,000*g离心10min,最后一次离心30min。 加入400ul低盐离子浓度缓冲液于柱子上,4℃,14,000*g离心10min, 重复3次。最后收集浓缩靶蛋白溶液。 分析蛋白溶液的浓度,采用考马斯亮蓝法(Bradford法)详情参考《HPR(羟基丙酮酸还原酶)酶活的测定以及DN-CaRop1和CA-CaRop1对HPR酶活的影响》。 SDS分析亲和差异 洗脱的靶蛋白浓缩溶液加入5*SDS上样缓冲液至终浓度为1-2*,混匀,沸水浴10min,离心上样。上样量约为30ul,顺序为: M,GST+对照、CA-GST+对照、CA-GST+青枯病处理 (12%凝胶) M,GST+对照、CA-GST+对照、CA-GST+青枯病处理 (7.5%凝胶) * 注意制胶前,清洗干净玻璃板,梳子等,确保除干净干扰

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