天花粉蛋白功能及其在植物病虫害防治中应用.docVIP

天花粉蛋白功能及其在植物病虫害防治中应用 　　摘要 介绍天花粉蛋白的分子结构和功能的相互关系，天花粉蛋白基因在原核及真核生物中的表达及对真菌、植物病毒和害虫抗性的研究进展，提出了用天花粉蛋白基因进行生物防治的研究方向。 　　关键词 天花粉蛋白（TCS）；病虫害；生物防治 　　 　　天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）是从葫芦科药用植物栝楼块根中分离得到的单链核糖体失活蛋白（Ribosome Inactivating Protein，RIP），它是中草药天花粉的有效成分。根据《本草纲目》的记载，天花粉的主要功效是“通月水，治胞衣不下”[1]。天花粉蛋白不但在医学方面有很重要的价值，而且与植物的防御反应相关。它对病毒、真菌和昆虫有直接或间接的抑制和杀灭作用，能够抗烟草花叶病毒等7种病毒、稻瘟病菌等9种病原真菌及蚜虫等4类害虫。近年来，研究者们揭示了天花粉蛋白参与了植物细胞代谢、细胞死亡等生理调控过程，并诱发细胞的程序化死亡而导致细胞死亡[2]，天花粉蛋白在植物防御反应中扮演了重要角色。 　　 　　1天花粉蛋白的分子结构和功能相互关系 　　 　　1.1 天花粉蛋白的分子结构 　　天花粉蛋白分子是由247或248个氨基酸残基（其C端的氨基酸有Ala和Met的不均一性，即有一种TCS比另一种在C端多了一个Ala，不过这两种蛋白质的性质基本相同）组成的单一多肽链，分子量为26kD，等电点为9.4，属碱性蛋白。它是由19种氨基酸构成，不含二硫键、糖基侧链，也没有磷酸化位点等其他蛋白质修饰位点，是一种简单的蛋白质[3]。 　　潘克桢根据Collins提出的TCS氨基酸序列，通过重建TCS分子模型并在2.6 ??分辨率进行晶体修正，得到可靠的TCS分子的结构[4]。该结构表明TCS分子的二级结构由8段α螺旋和13条β链组成，α螺旋长短不一，α4、α5、α6为三段连续的α螺旋，且α5与活性中心有关；13条β链共组成4个β折叠层，最大的β折叠层由6条β链组成。从整体分子来看，α螺旋相对集中在蛋白质分子内部，而β链构成的β折叠层则分布在分子表面，这是TCS分子的显著特点。 　　 　　1.2天花粉蛋白的空间结构和功能的相互关系 　　徐琼芳等将TCS基因中编码22位的精氨酸的AGA密码子，定点突变成编码为亮氨酸的CTA密码子，并导入大肠杆菌BL21中得到高效表达，表达产物也能使核糖体失活，但功能降低10%[5]。如果将活性中心160位的Glu和189位的Glu都变成Ala，则其活性比TCS降低1 800倍。Shaw 等对天花粉蛋白Tyr14和Arg22进行了突变研究，结果表明，Arg22的改变对天花粉蛋白的活性也有较大的影响[6]。已经发表对天花粉蛋白活性有较大影响的其他位点还包括Gln156、Tyr70、Arg163、Lys120-Ile121-Arg122-Glu123。此外，还可以采用删除部分基因片段的方法研究天花粉蛋白的结构与功能的关系。试验结果表明，天花粉蛋白的活性中心可能在110～174位之间，结构基因N端虽然不含有活性中心，但是对N端的突变影响了蛋白质的空间结构，因而降低了TCS的酶活；结构基因C端的部分缺失可降低TCS的免疫源性[3]。 　　 　　2天花粉蛋白基因在原核及真核生物中的表达 　　 　　2.1天花粉蛋白基因在原核中的表达 　　Shaw重组了由栝楼根cDNA库中分离到的TCS基因，除去了信号肽，保留了成熟肽及C末端19肽的序列，同时增加了一个Met密码子作为起始密码，使TCS基因在大肠杆菌中表达[7]。鲍一明将含有N端信号肽编码序列的TCS基因克隆到大肠杆菌表达载体pJLA502质粒中，基因位于串联启动子PrPL控制下；在PrPL启动子上游存在着温度诱导的调控元件CI857，表达质粒转化大肠杆菌DH5α。经温度诱导后，得到了29kD的融合表达蛋白，产量约占细胞总蛋白量的5%[8]。聂慧玲等将分离得到的TCS前体基因进行适当改造，即在编码成熟肽的DNA序列前引进NcoⅠ位点CCATGG，同时将编码的第一个氨基酸残基从Asp改为Met，或引进NdeⅠ位点CATATG，在第一个氨基酸Asp前加上Met；另外在编码成熟肽的尾部DNA序列上加进终止密码子TAG和BamHⅠ位点GGATCC，并消除原来的NcoⅠ位点。然后，将改造好的TCS基因重组进pET-2d或pT7-7质粒载体，再转化受体菌BL21。用IPTG诱导进行表达。检测到重组TCS产物约占总蛋白的1/3以上，以溶解和包涵体两种形式存在。重组TCS对蛋白质合成的抑制活力及免疫活性均与天然的TCS相似[9，10]。 　　 　　2.2天花粉蛋白基因在真核中的表达 　　天花粉蛋白基因不但在原核生物中表达，同时也可在真核生物中表达。吕