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PAGE \* MERGEFORMAT 2 PAGE \* MERGEFORMAT 2 三、证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件 3.1 黑曲霉来源的转葡糖苷酶的功能类别及作用机理 3.1.1 功能类别 历史上，黑曲霉的alpha-葡萄糖苷酶基因aglA编码的酶分子的活性首先被鉴定为转葡糖苷酶（EC 4），即催化寡糖的D-葡糖基单元的水解和转移将1,4糖苷键转化成1,6糖苷键（转葡糖基化反应）。在实际工业应用中，该酶活将麦芽寡糖转化为异麦芽低聚糖，用于从淀粉生产异麦芽低聚糖糖浆。同样的，在使用糖蜜为反应底物时，转葡糖苷酶将不可发酵的糖例如棉子糖和水苏糖转化成蔗糖，半乳糖，葡萄糖和果糖，然后酵母可以将其发酵成酒精。 后期，该酶通过其蛋白质序列被重新分类为?-葡萄糖苷酶（EC 0，CAS编码9001-42-7），催化非还原末端(1→4)-连接的?-D-葡萄糖残基释放?-D-葡萄糖（水解反应）。基于氨基酸序列同一的同源性分析，编码具有上述两种酶活的蛋白质的基因在Genbank中被鉴定为aglA（Genbank登录号 HYPERLINK /protein/BAA23616 BAA23616， HYPERLINK /nuccore/D45356 D45356，Uniprot登录号： HYPERLINK /uniprot/P56526 P56526），酶蛋白的正确名称为?-葡萄糖苷酶（GenBank：BAA23616.1）。 3.1.2 作用机理 尽管该酶蛋白的官方命名是?-葡萄糖苷酶，在高麦芽糖底物浓度的反应条件下该酶分子显示转葡糖苷酶活性，其中麦芽糖与反应体系的水分子竞争成为糖基酶中间体中与酶暂时结合的葡萄糖残基的受体，两种酶催化反应的机制如下图所示。该酶分子的水解活性和转葡糖基化活性的比率随底物浓度而变化。水解反应在稀释的反应体系中为主导酶反应，而转葡糖基化反应在浓溶液的反应体系中为主导酶反应。 图3-1 黑曲霉?-葡萄糖苷酶催化水解反应和转葡糖基化反应的机理 因此，取决于反应条件，该酶可被称为?-葡萄糖苷酶或转葡糖苷酶。杜邦工业生物科技利用该alpha-葡萄糖苷酶的转葡糖苷酶活性开发出一种酶制剂产品，用于工业化大规模生产低聚异麦芽糖，因此本申请也会使用转葡糖苷酶的名称。本项目申请中基因改造的目的是在李氏木霉中表达来自黑曲霉的alpha-葡萄糖苷酶基因aglA。 3.2 拟添加的食品中添加与否的效果对比 本申请的商业化的转葡糖苷酶产品（Transglucosidase L-2000）利用黑曲霉来源的alpha-葡萄糖苷酶的转葡糖苷酶活性，在李氏木霉的基因工程菌中高效生产目标酶蛋白，将替代本公司目前的由非转基因黑曲霉生产的转葡糖苷酶产品。李氏木霉产蛋白能力较高，适合作为宿主菌开发并进行DNA重组表达，是酶制剂生产中常用的真菌表达体系。我们对宿主菌李氏木霉的安全性进行了全面的毒理学试验，证明其不致病、不产毒。通过多年的研发，我们所开发的李氏木霉生产菌与传统的黑曲霉相比，李氏木霉产酶的效率更高，生产过程更加稳定，从而节约了宝贵的资源，包括原料、能源和水。 在谷物加工中使用转葡糖苷酶的目的是把谷物淀粉中的低聚麦芽糖转化为低聚异麦芽糖（IMO）。根据我们的认知，使用转葡糖苷酶是从淀粉生产低聚异麦芽糖（IMO）的唯一方法，其反应原理如图3-2所示。 图3-2 转葡糖苷酶催化生成低聚异麦芽糖的反应原理 3.3 与同一功能类别的食品添加剂效果对比 在现有的食品安全国家标准：食品添加剂使用标准GB 2760-2014版中，已批准了来源于非转基因黑曲霉的转葡糖苷酶： 本申请的alpha-葡萄糖苷酶与GB 2760所列的黑曲霉来源的转葡糖苷酶是同一个酶分子，GB 2760只列出了该酶的转葡糖苷酶活性，没有列出其alpha-葡萄糖苷酶活性。就转葡糖苷酶活性而言，本申请中由李氏木霉表达的黑曲霉转葡糖苷酶于非转基因来源的转葡糖苷酶完全一样。 该酶可同时催化?-D-低聚葡萄糖的水解和转苷反应。转苷反应主要发生在葡萄糖基的6-OH上，从而使D-葡萄糖转化为异麦芽糖，以及从麦芽糖转化成潘糖。转苷反应也可发生在D-葡萄糖基的2-OH或3-OH上，形成曲二糖和糖化曲二糖，一部分回到4-OH上再形成麦芽糖。该酶作用于麦芽糖，可以产生等摩尔浓度的潘糖（4-?-葡糖基麦芽糖）和葡萄糖。转苷反应的结果是将低聚麦芽糖被转化成低聚异麦芽糖。在上述应用中，转葡糖苷酶作为加工助剂使用，在最终食品中并不存在（如下图3-3所示）。 图3-3 转葡糖苷酶催化由淀粉生成低聚异麦芽糖的生产流程 由于人类的消化系统能轻松消化?-D-1，4糖苷键，但不能消化?-D-1，6糖苷键，在非还原端含有高百分比的?-D-1，6糖苷键的低聚异麦芽糖具有抗肠道消化的