FCM定量细胞量和荧光探针修改.pptVIP

FCM 定量细胞参量和荧光探针 河北省肿瘤研究所左连富 石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下： ⑴样品中的碎片较多，所测得的DNA组方图质量不及新鲜组织好，组方图的峰位较宽CV值偏大。 ⑵异倍体率减少，由于组方图细胞峰CV值较大，一些近于二倍体的DNA异倍体峰被掩盖。 ⑶S期细胞百分比不如新鲜组织的S期计算精确，S期细胞的计算偏高，这仍然与CV值较大有关 PY荧光染色方法: ①配制PY母液，PY 1.0g溶于100ml蒸馏水，置4℃冰箱保存。 ②PY工作液：取1.0ml母液加入1mol/L，Ph4.7的醋酸缓冲液到l00ml，稀释为0.01%浓度(lmol/L Ph4.7醋酸缓冲液的配制: 冰醋酸11.55ml+蒸馏水 1000ml。无水醋酸钠16.4g+蒸馏水至1000ml。然后取冰醋酸液255ml十245ml醋酸钠，再加入200ml蒸馏水即成)。 ③DNA酶消化液配制:DNA酶0.05mg/ml，0.25mol/L枸橼酸，2.5mol/L氯化镁, 20mol/L Tris-HCL调Ph为6.0 ④取1×106/ml细胞，加入0.5mlDNA酶消化液，37℃消化20分钟，弃去DNA酶液，加入0.01% PY工作液1.0ml，室温下染色30分钟，PBS洗去染液，再加入1.0mlPBS上机检测。 2. 丫啶橙(AO)RNA荧光染色： AO是DNA/RNA 荧光标记的优良探针，当FCM DNA/RNA双参数定量分析时，AO只需要单一激发光488nm，当进行RNA单参数定量分析，可先将细胞DNA用DNase消化处理，DNA荧光就消失了，再进行RNA AO荧光染色，这时所测荧光量仅为RNA含量，详细染色方法，请参见DNA含量的AO 染色。AO染色的缺点是对管道的污染严重。 3. 甲基绿－派若宁Y对RNA荧光染色: 甲基绿－派若宁Y都是碱性荧光染料，甲基绿对细胞核DNA 染色具有特异性，这可能由于甲基绿的两个正离子根与DNA中阴离子的磷酸根相一致，而且两个正负离子距离相等，甲基绿与DNA分子的结合远强于派若宁Y，这主要与化学结构式中-N基因有关，还有一个碱性更强的三羟铵卤根，而派若宁Y中只有一个-N基团，因此派若宁Y竞争不过甲基绿与DNA分子的结合。还有人认为，DNA和RNA的聚合程度不同，DNA聚合程度高，甲基绿着色，RNA聚合度低与派若宁Y结合。 但DNA发生解链后便失去与甲基绿结合的能力，所以在染色过程中，须防止DNA解链效应的发生，甲基绿-PY对RNA的定量荧光染色，主要依据其化学物理特性，甲基绿与DNA分子结合能力强，可以屏蔽派若宁Y与DNA分子的结合，而达到PY－RNA染色，对RNA单参数定量分析的目的。在甲基绿-PY染色RNA时，必须严格控制染液的PH值，根据实验证明，当-pH值高时，PY不着色，只有pH值在4.7时，PY对RNA具有特异亲合性，当pH值极低时，甲基绿不着色，就起不到屏蔽PY与DNA结合的作用，甲基绿的pH值在5-7时都有很好的稳定性，与DNA分子具有很强的特异性结合能力。 甲基绿-PY染色方法： ①甲基绿染液的配制，浓度0.01%，pH值5-7。取甲基 绿0.01g+ 蒸馏水l00ml，甲基绿配制后，以纯氯仿提纯，由于甲基绿中混有甲基紫成分，在染色时，需将甲基紫洗去。方法为: 将甲基绿溶解后，放入分液漏斗中，加等量的纯氯仿洗，先充分摇荡数分钟，室温下静置，待该液分为两层，弃去下层的紫色氯仿，按此方法反复洗5-6次，直到洗不下紫色为止。 ②PY染液配制见前。 ③取1×106/ml单细胞样品，加入甲基绿0.5ml，室温下染色30分钟，PBS离心洗涤一次。然后加入PY0.5ml，室温下染30分钟，PBS离心洗一次，加入PBS 1.0ml上机分析。 以上介绍的几种RNA 荧光探针各具优缺点，AO虽是RNA定量分析的优质荧光染料，但其染色过程复杂，并对仪器管道污染严重。PY不足之处是其荧光量与RNA含量缺乏严格的量效关系。还有作者报道用HO/PY标记DNA/RNA荧光染色虽然具有重复性。染色过程简单，不污染管道，但需要双激发光源，仪器操作复杂。 4. 噻唑橙(ThiazoIe orange TO) 是网织红细胞RNA荧光染色新探针，计数网织红细胞对于评价骨髓红系造血活性以及对贫血性疾病的治疗疗效评价具有重要意义。FCM已被引入定量分析网织红细胞RNA和计数网织红细胞。派若宁Y、花青苷类DIOCl(3) 、丫啶橙和硫黄素T等荧光探针被用于FCM分析网织红细胞RNA