第八节高液相色谱.pptVIP

液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph 液相色谱仪（2） 液相色谱仪（3） 1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性 固定液——非极性 3．正相色谱——固定液极性 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分,流动相为正己烷等。 反相色谱——固定液极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分，流动相主要为甲醇或水的溶 液等， b. 光电二极管阵列检测器 c. 示差折光检测器（differential refractive index detector） 示差折光检测器 d. 荧光检测器（fluorescence detector） 八、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%； HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 定量方法与气相色谱法基本相同。但由于很难查到相同实验条件下的定量校正因子，故使用校正归一化法较少。由于HPLC进样量较大，而且可以用六通阀定量进样，进样量误差较小，故常用外标法定量，一般要用外标工作曲线法检验线性范围及工作曲线是否通过原点，只有截距为零时，才能用外标一点法定量。 为了减小实验条件波动对分析结果的影响，一般每次测定都同时进对照品与样品溶液，称随行外标一点法，定量计算的方法与气相色谱法相同。 HPLC的内标法与气相色谱相同，且使用较少。 六、高效液相色谱仪操作步骤 1.过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。  2.对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。  3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。  4. 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5.冲洗泵：有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。 6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。选用合适的流速，走基线，观察基线的情况。  7. 设计走样方法。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。  8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。  9. 关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10. 登记。 七、HPLC的应用 　 高效液相色谱法的应用非常广泛，目前，HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的用途，而在生物和高分子试样的分离和分析中更是有明显优势。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有机酸；⑶甾体化合物；⑷生物硷；⑸抗菌素；⑹糖类；⑺卟啉；⑻核酸及其降解产物；⑼蛋白质、酶和多肽；⑽脂类等。 1. 作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。