聚丙烯酰胺胶双向电泳.pptVIP

* 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 第一部分 实验简介 一、实验目的 通过双向电泳实验，初步掌握电泳的基本理论、双向电泳实验的设计原理和实验技能。 二、实验原理 根据不同的蛋白质具有不同的分子量和等电点的特点。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将相同或相近等电点而分子量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过二维电泳分离的蛋白质在二维电泳图谱所处的位置，就是该蛋白质的相对分子量和等电点。 三、实验流程 蛋白样品的制备 ↓ 等电聚焦凝胶溶液的配制 ↓ 灌注毛细管凝胶 ↓ 组装第一向电泳槽 ↓ 聚焦电泳 ↓ 停止电泳 ↓ 取出毛细管胶 ↓ 毛细管胶置平衡液中平衡 ↓ 组装第二向电泳槽 ↓ 配制SDS-丙烯胺凝胶溶液 ↓ 灌装SDS-电泳胶 ↓ 第一向凝胶与第二向凝胶拼接 ↓ 接通电源进行SDS-电泳 ↓ 停止电泳取胶 ↓ 凝胶置固定液中固定 ↓ 银染法显色 ↓ 结果分析 第二部分 实验方法 第一向电泳——毛细管等电聚焦电泳（IEF） 1.仪器准备 双向电泳系统一套（见清单） 烧杯1000 mL 、50 mL 各1个 量筒1000 mL （或500 mL）、100 mL 、10 mL各 1个 注射器1 mL（带长针头）、微量注射器100μL（或50μL）各1支 大塑料盒1个 滴管1支 2．溶液配制 (1)覆盖溶液（25 mL/班） 含8 mol/L尿素，1%两性电解质pH 3~9.5，5% (w/v) NP40(Nonidet P 40 Substitute)和100 mmol/L DTT 取12 g尿素，0.25 mL两性电解质(pH 3~9.5)，12.5 mL的10%的NP40和0.386 g DTT，用重蒸水溶解后，定容到25mL。溶液不能受热,储存在冰箱中。 (2)平衡溶液（250 mL/班） Tris-HCl( pH 6.8)缓冲液，含2% SDS，100 mmol/L DTT和10%甘油 15 mL Tris-HCl(pH 6.8)，50 mL 10%SDS，3.86 g DTT和29 mL甘油，用重蒸水定容到250 mL，室温存放。 (3) 30% Acrylamide第一向储液（100mL/班） 含28.4% (w/v) acrylamide和1.6% (w/v) N,N-methylene-bis-acrylamide 用重蒸水先将1.6 g bisacrylamide溶解后，再加入28.4 g acrylamide，溶解，用重蒸水定容到100 mL。如果溶液混浊，需要进行过滤。溶液存放在棕色瓶中，4°C贮藏，3~4星期内使用。 (4) 10%(w/v) NP40（20mL/班） 配制100 mL溶液，称量10 g NP40，用重蒸水定容到100 mL，室温存放。 (5) 20 mmol/L NaOH 配制500 mL，称0.4 g NaOH用蒸馏水定容到500 mL。 (6) 10 mmol/L H3PO4 配制2000 mL，量取1.35 mL H3PO4(85%)用蒸馏水定容到2000 mL。 (7)固定液 乙醇35mL，三氯乙酸10 g，磺基水杨酸3.5 g，加蒸馏水定容到100 mL。 (8)脱色液 乙醇25 mL，冰乙酸10 mL，加蒸馏水定容到100 mL。 (9) 10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵溶于1mL重蒸水中，在4oC冰箱中可保存3~4个星期。 3．实验步骤 (1)准备玻璃管 取4支18 cm的长玻璃管，洗净晾干。 (2)配制第一向凝胶溶液（8mL /4组） 配制方法见表1。 表1 第一向凝胶溶液配方 尿素 3.84 g 重蒸水 2.0 mL 30% Acrylamide储液 1.6 mL 搅拌溶解 10% NP40 1.5 mL 两性电解质(pH3~9.5) 0.50 mL 10% 过硫酸铵* 15 μL TEMED* 10 μL (3)灌制第一向凝胶（每组2人共制作4根胶柱） 取1支1