基因工程件第6-9章.ppt

* * 第六章 基因的转移技术 ? 第一节 基因的导入方法 所谓基因的转移技术就是将外源目的基因或DNA片段引人受体生物或细胞并检查其在转化细胞中表达结果的一种技术。 一．基因导入方法 1．细胞融合 10-6 2．微细胞介导的基因转移 小于或等于10-6 3．染色体介导的基因转移 10-6利用中期染色体DNA进行转移 4．脂质体介导的基因转移 约2×10-4先用脂质体包装DNA，然后与 细菌，植物原生质体融合 5．磷酸钙沉淀介导基因转移 10-3—10-7 6．原生质体融合术 约0.1—0.3%溶菌酶处理细菌，再与动物细胞，植物原生质体融合 7．显微注射法 约1—10%直接注射入细胞质或细胞核内 显微注射法—利用显微操纵器，将DNA直接注射到细胞核中 穿刺法—利用注射显微镜将微注射针固定，然后穿刺将DNA注入细胞核内 8．电脉冲介导的基因转移 10-4利用电脉冲改变生物膜透性，DNA可直接进入各种细胞 9．重组RNA病毒感染 约10—100%适用于动植物细胞 10．重组DNA病毒感染 约100%适用于各种细胞 11．直接转化法 包括：完整细胞或原生质体与DNA直接接触，DNA进入细胞内，这种方法适用于细菌，酵母菌，真菌和植物细胞。 12．接合转移法 适用于细菌之间和细菌与植物细胞之间，这种DNA转移是借助于某些质粒上的转移基因产物 13．超声波法 现已用于植物细胞，可能还可用于其它生物 14. 基因枪法 ?二．转移方法的选择 选择方法的依据： 1．转化频率 取决于以下几个因素： 1) 外源DNA能否易于进入宿主细胞； 2) 重组DNA分子能否自主复制 3) 标记基因表达效率 2.检测转化体的方法：是否具有选择压力 3.生物材料的种类：细胞大小，有无细胞壁，除去细胞壁后的原生质体能否易于再生 4.已有实验条件：仪器，载体种类等 第二节 转化体的检测 1.?药物抗性检测 如用于细菌, 真菌, 植物和动物细胞的各种抗生素抗性基因: Ampr, Kanr, Hygr, G418r, Tcr等 2.??遗传互补检测 如用于酵母菌的各种氨基酸, 核苷酸合成酶基因: LEU2, TRP1, TRP3, URA3等 3.?表型选择 如用于细菌, 植物和动物的LacZ, GUS等基因; 用于细菌的噬菌斑 4.?凝胶电泳 对于自主复制型载体, 可从转化子中提取质粒DNA, 然后经过电泳法进一步证实 5.? Southern杂交 对于整合型载体, 则应该利用DNA杂交法证实 第七章 基 因 表 达 第一节 研究基因表达的方法 研究基因表达应从以下几个方面考虑： 1）转录：起始，延长和终止。基因转录的调控主要是起始阶段 2）转录后修饰：hnRNA 的加帽，加尾，拼接 3）翻译：起始，延长和终止。调控亦是在起始阶段 4）翻译后修饰：蛋白质的糖基化，蛋白质水解反应，蛋白质的分泌等。 一．转录系统 1. 体外转录系统 1）分离RNA聚合酶，然后在体外进行待测DNA的转录反应 2）利用全细胞抽提液，加入外源DNA，目前使用最广泛的抽提液来自海拉细胞和KB细胞 3）利用具有SP6, T3和T7启动子的载体转录插入的外源DNA 2.??体内转录系统 先分离细胞核，再进行转录反应 二．翻译系统 体外翻译系统（In vitro translation system）又称之为体外蛋白质合成系统(in vitro protein synthesis system)，是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDS—PAGE后可检测出翻译活性。? 常用翻译系统有以下几种： 1. 兔网织细胞裂解物(reticylocyte lysate system) 由未成熟的兔红细