第20章高液相色谱法.pptVIP

第20章 高效液相色谱法(HPLC) 20.1 概述 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液 相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 20.2 基本理论和条件选择 一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择 一、塔板理论 二、速率理论（与GC对比） 图示 back 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布 均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相， 匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右 20.3 各类高效液相色谱法 一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（BPC） 三、化学键合相色谱法（BPC） （一）化学键合相 （二）反相键合相色谱 （三）正相键合相色谱 （四）离子对色谱和离子抑制色谱 （一）化学键合相 P526 利用化学反应将固定液的官能团键合在硅胶 载体表面 特点： 1）不易流失 2）热稳定性好 3）化学性能好 4）载样量大 5）适于梯度洗脱 （二）反相键合相色谱 流动相极性 固定相极性 1．固定相：非极性的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%） 非极性的烷基C数越大，极性越低。 2．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水，pH=2~8 3．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 4．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 5．适用：非极性~中等极性的分子型化合物 （三）正相键合相色谱 流动相极性 ＜ 固定相极性 1．固定相：极性大的氨基或键合相 2．流动相：极性小（同LSC） 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 3．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑， k↓,组分tR↓. 4．出柱顺序：结构相近组分， 极性小的组分先出柱 ， 极性大的组分后出柱 5．适用：分析极性大物质、糖类分子型化合物等 （四）反相离子对色谱(RPIC) 流动相极性 固定相极性 20.5 反相键合相色谱中的流动相 (1)GC：？ (2）HPLC：选择流动相．即改变流动相的组成与浓度配 比来提高分离度，途径有 ①提高n：选择较小的u, 长柱，采用dp小的 固定相， 匀 浆装柱。 ②提高α：改变溶剂．填料等。 ③提高k：改变溶剂的配比、极性，使k在2一5。 ④梯度洗脱：在同一分析周期内。按一定程序不 断改变流动相的浓度配比。 1．对流动相的要求： 1）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度 k=1~10 k=2~5 最理想的 3）与检测器匹配： UV , 荧光，电化学 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气 2．洗脱方式 1）等度洗脱（恒定组成溶剂洗脱） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和配比 适于分析极性差别较大的复杂样品（类似GC的程序升温（沸程较长样品） 反相离子对梯度洗脱色谱法测定甲麻芩苷那敏片中3 组分含量 色谱柱: Inertsil ODS23 ( 250 mm ×4.6 mm , 5μm) ; 进样量:50μL ; 流速: 1 mL/min ; 检测波长:215 nm。流动相: [ 0.12 %辛烷磺酸钠溶液－三乙胺 (100∶0.12 ,磷酸调pH 至4.13) ]－甲醇(50∶50) 为流动相A ,甲醇为流动相B。0～30 min 内流动相B 的比例由1 %匀速递增至98 % ,30 min 以后,用流动相A进行洗脱。 20.6 高效液相色谱仪 1．输液泵： 2．进样装置－六通进样阀 3 色谱柱直径4~6mm,柱长10~30cm柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 4．检测器 1）紫外检测器：特点 2）荧光检测器： 3）示差折光检测器： 4）电化学检测器 5）化学发光 光电二极管阵列检测器 小结 掌握范式方程及分离度方程的物理意义 掌握正相色谱反相色谱 掌握反相键合相色谱法的概念及实验条件的选择 掌握定量