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实验十八 豆科植物根瘤、根瘤细菌的形态观察及其分离 豆科植物根瘤、根瘤细菌的形态观察及其分离 目的要求 实验材料 实验程序 思考题 目的要求 观察几种豆科植物的根瘤和根瘤细菌的形态。 掌握从根瘤中分离根瘤细菌的方法及培养的方法 实验材料 不同豆科植物新鲜标本数株，不同豆科植物的浸制标本。 加入结晶紫的根瘤菌培养基（10mL）。 无菌培养皿、接种环、1mL无菌水、2mL无菌水、手术剪、无菌玻棒、载玻片、镊子、酒精灯、显微镜、二甲苯、香柏油、擦镜纸。 0.1%升汞液。革兰氏染色液一套。 实验程序 观察豆科植物根瘤和根瘤细菌的形态。 分离豆科植物根瘤菌 实验程序Ⅰ （观察豆科植物根瘤和根瘤细菌） 观察几种豆科植物根部根瘤的形状、色泽、以及着生部位，识别有效根瘤和无效根瘤，或观察几种豆科植物浸制标本的根瘤形状，并绘图。 观察根瘤细菌的形态：用镊子取根瘤1个，洗净后放在洁净的载玻片上，加蒸馏水1滴，然后再用另一洁净载玻片在这根瘤上轻轻压出根瘤中的汁液，再取此汁液用接种环涂片，（亦可用分离到的根瘤菌悬液涂片），用简单染色法染色，油镜下观察并绘图。 实验程序Ⅱ （ 分离豆科植物根瘤菌） 选择1株生长健壮的豆科植物，在主根部位选择1个红润饱满的较大根瘤，连同1小段根剪下，以免损伤根瘤，用清水洗净。 将根瘤浸泡在75%酒精的无菌培养皿中，5min后，用镊子将根瘤转入盛有%升汞（HgCl2）溶液的无菌培养皿中浸泡2—3min，以杀死根瘤表皮附着的杂菌，消毒时间一到，马上用无菌镊子将根瘤转入盛有无菌水的培养皿中，用镊子翻动几次，然后用镊子挟起根瘤，再用无菌水冲洗几次，洗去残存的升汞液。 将已消毒的根瘤放入装有1mL无菌水的试管中，用无菌玻棒轻轻挤压根瘤，制成根瘤菌悬浊液备用。 实验程序Ⅲ （ 分离豆科植物根瘤菌） 取已融化的根瘤菌培养基以无菌操作制成平板（2付培养皿）待用。 取上面已凝固的根瘤菌平板，用接种环在无菌操作下取一环根瘤汁液进行分离（连续划线或分区划线）。 倒置28~300C培养。一般快生型根瘤菌（蚕豆、豌豆、苜蓿、三叶草、紫云英根瘤菌）培养3—5d，慢生型根瘤菌（大豆、花生、豇豆）培养7—10d即可长出菌落。 观察菌落形态，并进行描述；选取典型菌落进行涂片，革兰氏染色，油镜下观察并绘图。将典型的单菌落转接到斜面培养基上，得到根瘤菌纯种，用作菌种保藏。如不纯，应再次划线分离。 思 考 题 分离根瘤菌时，为什么要进行根瘤表面的消毒？ 为什么有效根瘤往往生长在主根上？并呈粉红色？ 实 验 十 八 结 束 * * * * *