第七章生物大分子的色谱分离纯化120319.ppt

复 习 浓差极化 浓差极化是指在超滤过程中，由于水透过膜，因 而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，在浓度 梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达 到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界 层，它对水的透过起着阻碍作用. 复 习 膜的污染 膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流 速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这 被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物 (附生)污垢所引起的。 复 习 防止膜污染的方法 （1）预处理法 调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学 劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生 物性劣质等。 （2）开发抗污染的膜 （3）加大供给液的流速 第七章 生物大分子的色谱分离与纯化 色谱分离图示 色谱分离图示 三 、层析的分类 ⑴根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类 ⑵ 根据实验技术的分类 ⑶ 根据固定相的形状不同的分类： ⑷ 根据流动相的物态不同的分类 ⑸ 操作方式不同的分类 层析分类 吸附色谱与其它色谱法的异同点 1.5 层析剂种类 为何选择色谱作为生物分子纯化方法？ 不产生热 不产生外力 高回收率 高分辨率 线性放大，可预期 可自动化 大量成功例子 Principles of Operation for Chromatography Techniques 第七章 生物大分子的色谱分离与纯化 2.分离对象:酶、多糖﹑蛋白质﹑核酸等. 3.分离类型:分析色谱 (10 mg) 中等规模制备色谱(10-50mg) 制备色谱 (0.1-1g) 工业生产规模色谱 (20g/d) 制备色谱技术 制备液相色谱系列 7.色谱法的应用 (1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。 第一节 基本理论 一﹑计量置换保留理论 分析色谱与制备色谱: 分析色谱 灵敏度 进样量 毛细管柱色谱 制备色谱 分离与纯化较多的 产品 增加进样量 (2) 溶质计量置换吸附理论: 当一个溶质被吸附剂吸附时，在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一定数目的溶剂分子。 用计量置换这一概念和相同的热力学平衡，将多年来物理化学家和色谱学家各自独立进行研究的液-固吸附机理及溶质在液相色谱中的保留机理统一起来。 第一节 基本理论 二﹑有效柱长和最短柱长 在实际应用中，一般认为色谱柱的长径比为10，是色谱柱较为合适的几何比例。对于生物大分子而言，它的保留主要是由流动相中置换剂的浓度决定的，柱长对生物大分子的分离几乎没有影响，有时会出现短柱较长柱的分离效果还好的情况。 二﹑有效柱长和最短柱长 不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的线速度时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献，此时溶质迁移所经历的柱长也对分离有贡献；而当不同溶质在其迁移速度等于流动相的线速度时，溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。 二﹑有效柱长和最短柱长 有效柱长（Leff）：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离。又叫有效迁移距离。 最短柱长(Lmin)：混合溶质中使一对最难分离的溶质1和溶质2的分离度Rs=1时所需的最短距离。 第二节 装置和操作技术 装置包括：流动相供给、进样、色谱柱和 检测器4大部分。 1.柱色谱系统的组成 色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成。 柱层析系统的组成 柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成： A 蠕动泵 B 层析柱 C 装柱 D 加试样 E 洗脱 F 检测器 G 部分收集器 柱层析装置图 2 纸层析法 2.1 基本原理 2.2 操作方法 2.3 操作步骤 小实验 当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。 滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。 看看接下来会发生什么事情… 可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。 这就是纸层析法。 对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。 纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。