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第十一章 酶技术 第十一章 酶技术 定义：以酶为研究对象的各种生化技术的统称。 包括：酶生物合成的调节技术 酶的分离纯化技术 酶反应动力学研究技术 酶的分子修饰技术 酶、细胞核原生质体固定化技术 第一节 酶生物合成的调节 （一）基因调控理论  Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory） 　 调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。 诱导物的选择 分为三类 （1）酶的作用底物； （2）酶的反应产物； （3）酶的底物类似物：最有效 酶诱导合成的条件 （1）基因必须完整。 a. 结构基因改变 b. 同一操纵子中第一个结构基因破坏 c. 操纵基因变异 d. 调节基因变异 酶诱导合成的条件 （2）阻抑蛋白本来与操纵基因的亲和力强，两者原来结合在一起，使酶不能合成； （3）在添加诱导物时，细胞所处环境中，不能有高浓度的分解代谢阻遏物或其他强阻遏剂存在，否则将无法诱导。 酶诱导合成的检测 一般通过测定酶活力的方法进行检测。 胞外酶：诱导一定时间后，取培养液测定酶活力； 胞内酶：破碎细胞后测定酶活力。 2.末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象： 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。 色氨酸操纵子——酶的阻遏 酶的诱导和阻遏操纵子模型 3.分解代谢物阻遏 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。 分解代谢物阻遏现象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。 分解代谢物阻遏 第二节 酶反应动力学的研究 主要包括： 酶反应初速度的测定 底物浓度对酶反应速率的影响 米氏常数和最大反应速度的测定 温度、pH、抑制剂等对反应速度的影响 酶反应活化能的测定 激活剂的作用 抑制类型的确定 一、酶反应初速度的测定 为正确测量酶促反应速度并避免干扰就必须测定反应初期干扰因素还来不及起作用时的速度，称之为反应初速度。 （1）测量单位时间内底物的消耗量 （2）测量单位时间内产物的生成量 测定的一般步骤 （1）选择适宜的底物； （2）确定酶反应的温度和pH条件； （3）准备就绪后，将酶液加到底物中，开始反应，计时； （4）每隔一定时间测定产物生成量； （5）作图：以反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标作图。 二、底物浓度对反应速度的影响——Km和vmax的测定 在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。 Km和vmax的测定 求Km和vmax采用直接作图法 从v－[S]图，找出1/2 Vmax ，查出[S]＝Km 但[S]无论怎样大，也只能趋近Vmax，故1/2 Vmax不准，且点也要多。 (1). 双倒数作图法（最常用） 改写M氏方程为：1/v = Km/Vmax ?(1/[S] )+ 1/ Vmax (2). 伊蒂-霍夫斯第方程 三、最适温度、热稳定性和活化能的测定1.最适温度测定 ? 在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快 ? 酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快 ? 酶的最适温度不是一个固定不变的常数 2. 热稳定性测定 测定方法： （1）温度不同，作用时间相同时的酶反应速度，计算不同温度下相对酶反应速度； （2）测定较高温度下，不同时间的酶反应速度。 3.活化能测定 反应活化能