掌握用考马斯亮蓝Cooassie.pptVIP

XI. Observation on cytoskeleton A、dye by Coomassie blue  【Purpose】 掌握用考马斯亮蓝（Coomassie blue） R250染色法观察植物细胞骨架的方法。 【Principle】 细胞骨架(Cytoskeleton) 组成：主要包括微管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散，微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维则分布在整个细胞中。 细胞骨架作用：具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。 细胞骨架的研究方法：考马斯亮兰R250染色法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法、间接免疫荧光法等。 考马斯亮兰R250染色法的原理：考马斯亮蓝R250可以对各种蛋白质进行染色。细胞骨架有一个特性，即用非离子去垢剂（如Triton X-100）处理时，可以保持非溶解状态。当用这类试剂处理细胞时，细胞内其它可溶性的物质和膜成分都被抽提出来，只留下细胞骨架。考马斯亮蓝R250虽不能对微丝进行特异性染色，但当其它蛋白成分被抽提后，就能清晰地显示微丝束的形态。 [Apparatus, material and reagent] 光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片； 新鲜洋葱鳞茎; [experiment protocol] 1、撕取洋葱鳞茎内表皮(约1平方厘米)置于2~3ml pH6.8 磷酸缓冲液中待其下沉(烧杯1) ； 2、用2~3ml 1%Triton X-100处理20 min(烧杯1) ； 3、吸去Triton X-100，用M缓冲液2~3ml洗2次，每次5 min (烧杯1) ； 4、 2~3ml 3%戊二醛固定40 min(烧杯2) ； 5、pH6.8磷酸缓冲液2~3ml洗2次，每次5 min，滤纸吸去残液(烧杯1) ； 6、 2~3ml 0.2%考马斯亮蓝R250染色15分钟，然后用蒸馏水小心冲洗1～2次(烧杯1) ； 7、将表皮铺放在载玻片上，加盖玻片，在高倍显微镜或者油镜下进行观察。 cytoskeleton Cytoskeleton of onion cell B、 dye by Rhodamine-Phalloidin 【purpose】 熟悉细胞骨架固定染色的方法，掌握用荧光标记的鬼笔环肽显示微丝的原理和方法。 【principle】 鬼笔环肽能够特异地与微丝紧密结合。荧光标记的鬼笔环肽能够在荧光显微镜下显示微丝的形态和结构。 [apparatus, material and reagent] 试剂 1.细胞骨架稳定液(CSB ，pH 6.1)：10 mM MES; 138 mM KCl; 3 mM MgCl; 2 mM EGTA; 0.4M 甘露醇 2. PBS：含0.1% 的TritonX-100 3.封闭液：PBS; 0.1% Ttiton X-100; 2% BSA 4.微丝荧光染料：0.4 μg/ml罗丹明标记的鬼笔环肽（Rhodamine-Phalloidin） (用封闭液配制；贮存液为0.2mg/ml，临用前稀释) 5.封片液： PBS; 0.1% p-phenylenediamine(抗淬灭剂); 90% 甘油 Experiment protocol 撕取洋葱内表皮,用5ml含有0.25%戊二醛和0.25% Triton X-100的CSB处理1-2分钟(烧杯1)； .0 用5ml含有1%戊二醛的CSB固定20分钟(烧杯2) ； 用5ml含有0.1%NaBH4 和0.1% Ttiton X-100的PBS清 洗10分钟(临用前配置)(烧杯3) ； 4.用5ml含有0.1% Ttiton X-100的PBS清洗两遍，每次5分钟(烧杯4) ； 5.用5ml封闭液处理10分钟(烧杯4) ； 6.用0.3ml 的0.4 μg/ml荧光染料避光染色20分钟(EP管)； 7.用5ml含有0.1% Triton X-100的PBS清洗两遍，每次5分钟(烧杯4) ； 8.在载玻片上滴加1-2滴封片液，将洋葱表皮平铺其上，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。 肌肉细胞微丝染色 * * 6mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）、M缓冲液、1%Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝R250、3%戊二醛。 光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片； 新鲜洋葱鳞茎;