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项目四细胞工程制药技术 主要内容： 细胞培养 细胞融合、重组 单克隆抗体制备与应用 模块一、必备知识 细胞工程:以细胞作为研究对象，运用细胞生物学、分子生物学等学科的原理与方法，按照人们意愿设计改造细胞某些遗传性状，从而培育出新的生物改良品种或通过细胞培养获得自然界中难以获得的珍贵产品的生物技术。 第一节 细胞培养技术 细胞培养条件： 1、营养 2、生长环境 （一）动物细胞培养技术 动物细胞体外培养具有明显的表达产物方面的优点，为传统的微生物发酵技术所无法替代。其中以它们转录后修饰和产物胞外分泌表达最为人们所感兴趣。 二、动物细胞培养特征 贴壁依赖性细胞 非贴壁依赖性细胞 兼性贴壁依赖性细胞 ⒈贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面,自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型 ⒉悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 ⒊兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国仓鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。 三、动物细胞培养技术 原代培养：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，是检测药物很好的实验对象。 传代培养：将培养细胞从培养器中取出，把一部分移至新的培养器中再进行培养。 原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长 。 1、有限细胞系 2、连续细胞系 四、动物细胞培养的营养条件 特点： 1、细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素； 2、动物细胞较微生物大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差； 3、培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌； 4、在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性； 5、培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵 6、大规模培养时，不可套用微生物反应的经验： 7、原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。 培养基组成 1、天然培养基 血清 水解乳蛋白 胚胎浸液等 2、合成培养基 氨基酸 维生素 糖 无机盐等 加10%-20%血清 血清的优点？ 缺点？ 无血清培养基 五、环境条件 1、无毒无菌 2、温度 温度除直接影响到细胞生长外，与培养液的pH值也有关。如低温时可增加CO2的溶解性而影响pH。最理想的做法是把配有血清的培养液，置于36.5℃中。过夜，然后再用于培养。 3、渗透压人类血浆的渗透压为770kPa，小鼠类则为820 kPa。培养液的渗透压一般介于(690～850)kPa之间，能为多数细胞所耐受。 4、气体环境与pH pH 7.2-7.4 六、保存与运输 保护剂：DMSO 、甘油 -80度或（-196度）液氮 七、动物细胞大规模培养 大规模培养动物细胞生产生物制品大约始于本世纪50年代，Earle等开发出细胞培养基之后，主要是用于生产病毒疫苗。 最初的生产方法是采用成百上千只体积小的培养瓶，后来又改用滚瓶培养。 1967年，Van Wezel开发了适合贴壁细胞生长的微载体，使得动物细胞的培养能够在搅拌釜式反应器中进行，大大提高了生产率。 1972年，Knazek开发了中空纤维反应器，使得细胞密度大为提高。 1975年，Koholor和Milstein创立了细胞融合技术，使得悬浮细胞的培养变得十分迫切，气升式反应器被应用于杂交瘤细胞的培养，以生产单克隆抗体。 1978年，Lim还开发了细胞微囊化技术，将非贴壁依赖性细胞包含在较小的颗粒状微囊中，使培养在搅拌釜式或气升式反应器中进行，并放大至1000L规模。 模块二、操作技术 一、细胞融合 细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。 2、细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。 3、融合的基本过程 细胞准备